Se o genoma carrega todas as informações necessárias para um organismo viver no seu ambiente, por que apagar genes pode ser benéfico em algumas situações, como na biomanufatura? No último texto da nossa série, conversamos sobre a principal tecnologia da atualidade para a modificação genética, a CRISPR-Cas9. Hoje, iremos discutir como a deleção estratégica de genes, aliada à modificação destes, pode auxiliar na produção de bioprodutos.
Você disse deleção de genes? Mas o que é isso?
Bem, sabemos que o genoma de um organismo, seja RNA ou DNA, é o conjunto de moléculas que carrega as informações necessárias para produzir todas as proteínas (e outras moléculas) que são necessárias para a vida existir. Vamos considerar a nossa espécie: temos 23 pares de fitas de DNA, com cada uma dessas contendo uma parte da informação genética para gerar um ser humano.
O genoma é formado por sequências de nucleotídeos (as famosas “letrinhas”) que codificam uma ou mais proteínas em específico. Essa sequência codificadora – junto com vários outros elementos que não vêm ao caso aqui – é chamada de gene. Aqui necessito fazer uma pequena ressalva para os biólogos de plantão: sim, sei que essa explicação é terrivelmente simplista, e que a definição de gene é alvo de constantes disputas e debates nas ciências biológicas, variando tanto no tempo quanto na área de estudo. Entretanto, como o foco desse texto não é isso, vou me ater a essa definição.
A deleção ocorre quando há a remoção, inativação ou perda integral ou parcial de um gene. Esses eventos podem acontecer tanto naturalmente, por meio de uma mutação, quanto durante a divisão celular ou mesmo artificialmente, utilizando a técnica de CRISPR-Cas9, como conversamos anteriormente. O ponto importante é que, normalmente, a deleção vem acompanhada da perda de função desse gene. Embora pareça contraintuitivo que perder informação seja vantajoso, na biotecnologia industrial essa estratégia funciona como a simplificação de um maquinário: ao remover peças redundantes, a célula economiza energia para focar na produção do bioproduto desejado.
Mas o que a deleção de genes tem a ver com proteínas?
Genes podem codificar os mais diferentes tipos de proteínas, e elas mesmas podem ser classificadas de diferentes formas. Para compreender o impacto de deletar um gene, precisamos olhar para as proteínas que ele codifica. Na célula, elas desempenham funções tão diversas quanto os componentes de uma cidade: atuam como tijolos estruturais que dão forma à célula, mensageiras químicas (como os hormônios) que transmitem sinais e defensoras contra invasores (como os anticorpos). Entretanto, no cenário da biomanufatura, dois tipos de proteínas são protagonistas: as enzimas, que atuam como aceleradoras de reações químicas, e as proteases, que atuam como “trituradores moleculares”, encarregadas de degradar outras proteínas.
É preciso também mencionar que essas funções não são mutuamente exclusivas. Uma proteína normalmente tem mais de uma função e existem muitas outras que não mencionei. Por exemplo, os anticorpos são tanto proteínas de defesa quanto de sinalização, e há um tipo de anticorpo que é uma proteína de membrana. As fosfoquinases são enzimas cuja principal função é atuar como proteínas sinalizadoras. Além disso, em muitos casos, é necessário combinar várias proteínas para que elas desempenhem suas funções.
Mas, se os genes são tão importantes, por que a deleção deles pode ajudar?
No contexto de biomanufatura que venho descrevendo nas últimas semanas, a melhor pergunta a fazer não é “por que deletar genes”, mas sim “quais genes deletar”. Bem, vamos pensar em tudo o que já conversamos sobre isso até o momento e tomar como base as pesquisas realizadas no projeto BEYOND do LEBIMO.
Ao desenvolver um processo de biomanufatura em que os pesquisadores têm interesse – por exemplo, para produzir um medicamento – eles colocam o seu organismo produtor (no caso, o fungo Aspergillus oryzae) em um biorreator com todos os nutrientes que este precisa e com as melhores condições ambientais possíveis para ele crescer e produzir o bioproduto que desejam. Dentre os nutrientes necessários está a glicose, um tipo de açúcar mais simples que as células do fungo utilizam para produzir energia.
Na natureza, o A. oryzae possui um conjunto de enzimas que utiliza para quebrar o amido (um tipo de açúcar mais complexo) em pequenas unidades de glicose. Essas enzimas, como comentado anteriormente, são chamadas de amilases. No contexto da biomanufatura, em que os pesquisadores fornecem a glicose “pronta” ao fungo, este – teoricamente – não precisaria mais produzir amilases. Contudo, isso não é o que acontece. As células fúngicas continuam produzindo esta enzima, seguindo as ordens do seu genoma. Nesse sentido, os cientistas se perguntaram:
“já que estamos dando a fonte de energia para os fungos, e se trocarmos os genes das amilases pelos genes da proteína recombinante que temos interesse? Será que essa será produzida no lugar sem afetar todo o resto da biologia da célula? “
E o que foi visto é que aparentemente sim! Tecnicamente, os genes das amilases (e de outras proteínas) não foram completamente deletados. Na verdade, o que os pesquisadores fizeram foi retirar a parte desses genes que codifica a proteína – mantendo quase todas as outras partes relacionadas à regulação desse processo – e colocar em seu lugar a sequência codificadora para as proteínas recombinantes de interesse. No final desse processo, o que os cientistas viram é que a produção de proteínas recombinantes não foi afetada, assim como o funcionamento do resto da célula.
A estratégia se assemelhou a uma reforma em uma linha de montagem industrial. Ao invés de construir uma nova fábrica, os pesquisadores aproveitaram a infraestrutura de regulação e produção proteica já presente no fungo. Ao remover apenas a sequência de instruções genéticas que moldam a amilase e inserir, no mesmo local, o molde da proteína de interesse (como um biofármaco), os pesquisadores “enganaram” a célula. O fungo passou a produzir o medicamento utilizando os mesmos comandos que usava antes para fabricar suas próprias enzimas.
Isso parece bem útil! Mas a deleção de genes pode causar algum problema às células?
Atualmente, essa é uma das estratégias que está sendo estudada para a otimização da produção em bioprocessos. Por exemplo, no projeto BEYOND, alguns pesquisadores estão estudando como a deleção de genes – da amilase, de proteases e de proteínas envolvidas no metabolismo da celulose – pode influenciar a produção de proteínas recombinantes em Aspergillus oryzae. A ideia é que, se as células pararem de produzir essas proteínas, haverá tanto um aumento da disponibilidade de recursos celulares para a síntese de proteínas recombinantes de interesse quanto uma redução da chance de que estas sejam destruídas pela própria célula.
Contudo, esse processo de deletar genes não é tão simples quanto parece. A primeira dificuldade, até alguns anos atrás, era a tecnologia para isso; entretanto, esse ponto foi parcialmente superado pela CRISPR-Cas9. Uma outra dificuldade é saber qual candidato a gene é uma boa escolha para ser deletado, pois raramente um gene opera de forma isolada (como somente na produção de uma proteína); frequentemente, um único gene influencia a regulação de vários outros, inclusive em pontos distantes do genoma.
Além disso, como comentado anteriormente, as proteínas podem desempenhar mais de uma função. Dessa forma, é preciso considerar não só o impacto da deleção do gene, como também o impacto da deleção da proteína no conjunto proteico da célula. Por exemplo, genes que codificam proteínas relacionadas ao metabolismo de substâncias presentes na natureza, mas não em um biorreator (como a amilase), são bons candidatos. Mas esses casos são raros e ainda é preciso realizar muitos testes antes de se considerar que a ausência de um gene e de uma proteína realmente será benéfica para um bioprocesso.
Outros candidatos à deleção são as proteases, enzimas envolvidas na degradação de proteínas. Embora indesejadas por degradarem nosso produto de interesse, elas desempenham papéis vitais na reciclagem de componentes celulares. Remover esses ‘trituradores’ sem comprometer a viabilidade do fungo exige um ajuste metabólico muito preciso. No próximo texto, vamos entender qual o balanço que deve ser feito ao se trabalhar com as proteases em bioprocessos (e por que, muitas vezes, elas são problemáticas).
| O presente trabalho foi realizado com apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Brasil. Processo nº 2025/23381-7. As opiniões, hipóteses e conclusões ou recomendações expressas neste material são de responsabilidade do(s) autor(es) e não necessariamente refletem a visão da FAPESP. |
Para saber mais:
- ARENTSHORST, Mark et al. A CRISPR/Cas9‐based multicopy integration system for protein production in Aspergillus niger. The FEBS journal, v. 290, n. 21, p. 5127-5140, 2023.
- DALVIE, Neil C. et al. CRISPR-Cas9 knockout screen informs efficient reduction of the Komagataella phaffii secretome. Microbial Cell Factories, v. 23, n. 1, p. 217, 2024.
- KASTBERG, Louise La Barbera et al. Burden imposed by heterologous protein production in two major industrial yeast cell factories: identifying sources and mitigation strategies. Frontiers in Fungal Biology, v. 3, p. 827704, 2022.
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