O CRISPR-Cas9 \u00e9 um sistema de edi\u00e7\u00e3o gen\u00e9tica de alta precis\u00e3o, descoberto originalmente como um \u201csistema imunol\u00f3gico\u201d de bact\u00e9rias usado para proteg\u00ea-las de infec\u00e7\u00f5es virais, e que utilizado como uma t\u00e9cnica de biologia molecular permite remover, adicionar e\/ou trocar sequ\u00eancias de DNA localizadas em qualquer regi\u00e3o do genoma. <\/p>\n\n\n\n
A tecnologia da CRISPR-Cas9 se mostrou como uma ferramenta t\u00e3o ampla, vers\u00e1til e potente que praticamente todas as pesquisas envolvendo modifica\u00e7\u00f5es gen\u00e9ticas em bact\u00e9rias, fungos, plantas, animais e at\u00e9 humanos (embora ainda haja muitas barreiras e discuss\u00f5es \u00e9ticas no caso dos humanos) j\u00e1 a utilizam. Pesquisas agr\u00edcolas j\u00e1 t\u00eam aplicado em plantas para controle de placas, e o LEBIMO utiliza em fungos para o desenvolvimento de linhagens que expressem prote\u00ednas recombinantes.<\/p>\n\n\n\n
A sigla CRISPR-Cas9 traduz-se como \u201cConjunto de Repeti\u00e7\u00f5es Palindr\u00f4micas Regularmente Espa\u00e7adas em associa\u00e7\u00e3o com a nuclease Cas9\u201d. Complicado? Sim, mas vamos entender um pouco melhor. Para isso, vamos separar em duas partes:<\/p>\n\n\n\n
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- O CRISPR (Conjunto de Repeti\u00e7\u00f5es Palindr\u00f4micas Regularmente Espa\u00e7adas) nada mais \u00e9 do que um grupo de sequ\u00eancias de nucleot\u00eddeos (as famosas \u201cletrinhas\u201d do genoma) que se repetem diversas vezes em intervalos regulares e que, quando s\u00e3o transcritas para RNA, algumas dessas sequ\u00eancias se reconhecem e se associam, por serem complementares (da\u00ed o termo pal\u00edndromo).\u00a0<\/li>\n\n\n\n
- A Cas9 \u00e9 uma nuclease, uma enzima especializada em cortar DNA, que atua como um par de \u201ctesouras\u201d capaz de cortar especificamente as duas fitas de DNA em um local designado no genoma.<\/li>\n<\/ul>\n\n\n\n
Essa pequena mol\u00e9cula de RNA, produzida a partir do CRISPR, atua como um \u201cGPS celular\u201d. Conhecida como RNA guia (guide RNA<\/em> ou RNAg ou gRNA), ela fornece as coordenadas, direcionando a enzima Cas9 at\u00e9 o ponto espec\u00edfico do genoma que precisa ser cortado.<\/p>\n\n\n\n
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Como foi descoberta a CRISPR-Cas9?<\/strong><\/h2>\n\n\n\n
Em 1987, pesquisadores da Universidade de Osaka no Jap\u00e3o, perceberam pela primeira vez a presen\u00e7a de sequ\u00eancias CRISPR no DNA de bact\u00e9rias da esp\u00e9cie Escherichia coli, um organismo muito utilizado (chamado de \u201corganismo modelo\u201d) para pesquisas de gen\u00e9tica. Naquela \u00e9poca, ainda n\u00e3o se sabia o que eram essas sequ\u00eancias; contudo, como logo foi visto o mesmo fen\u00f4meno em outras esp\u00e9cies, chegou-se \u00e0 conclus\u00e3o de que deveriam ser importantes. <\/p>\n\n\n\n
Com o passar dos anos, a teoria do sistema imunol\u00f3gico de bact\u00e9rias (e organismos procari\u00f3ticos em geral) ganhou for\u00e7a ao se perceber que, entre as pequenas repeti\u00e7\u00f5es complementares, havia fragmentos de DNA de bacteri\u00f3fagos (v\u00edrus especializados em matar bact\u00e9rias); ou seja, as bact\u00e9rias tinham uma \u201cbiblioteca\u201d de informa\u00e7\u00f5es gen\u00e9ticas de potenciais \u201cpredadores\u201d.<\/p>\n\n\n\n
Em 2002, pesquisadores tamb\u00e9m notaram os primeiros genes associados \u00e0s sequ\u00eancias CRISPRs em bact\u00e9rias, dois deles com caracter\u00edsticas de helicases e nucleases, ou seja, enzimas que \u201cabrem\u201d as duas fitas de DNA e enzimas que cortam ambas as fitas de DNA. A essas enzimas foi dado o nome Cas, do ingl\u00eas, prote\u00ednas (ou genes) associadas a CRISPR. Essas primeiras pesquisas fizeram com que ganhasse muita for\u00e7a a hip\u00f3tese de que tais prote\u00ednas, genes e sequ\u00eancias CRISPR estavam envolvidas com a edi\u00e7\u00e3o de DNA nas bact\u00e9rias.<\/p>\n\n\n\n
Por fim, em 2007 e 2011, importantes avan\u00e7os foram feitos para se entender o mecanismo completo do CRISPR-Cas9. Entre esses anos, revelou-se que as sequ\u00eancias CRISPR eram transcritas em pequenas mol\u00e9culas de RNA e que esses pequenos RNAs direcionavam as prote\u00ednas Cas para mol\u00e9culas estranhas com informa\u00e7\u00e3o gen\u00e9tica, normalmente o genoma de v\u00edrus tentando infectar a bact\u00e9ria. <\/p>\n\n\n\n
O ponto de virada ocorreu em 2012, quando as cientistas Emmanuelle Charpentier e Jennifer Doudna publicaram um artigo demonstrando como o sistema CRISPR-Cas9 poderia ser programado para cortar qualquer mol\u00e9cula de DNA in vitro<\/em>. Essa descoberta, que transformou um mecanismo de defesa bacteriano em uma ferramenta revolucion\u00e1ria de edi\u00e7\u00e3o gen\u00e9tica, rendeu \u00e0s duas pesquisadoras o Pr\u00eamio Nobel de Qu\u00edmica em 2020.<\/p>\n\n\n\n
Como o sistema da CRISPR-Cas9 funciona na pr\u00e1tica?<\/strong><\/h2>\n\n\n\n
Tudo come\u00e7a quando os pesquisadores decidem e conhecem previamente uma sequ\u00eancia no DNA que querem alterar, por exemplo, uma muta\u00e7\u00e3o que se quer retirar por causar uma doen\u00e7a ou o gene de uma prote\u00edna recombinante que se quer adicionar ao genoma. A partir disso, o RNA guia (comentado acima, no primeiro t\u00f3pico) \u00e9 sintetizado quimicamente para se ligar a essa regi\u00e3o espec\u00edfica do genoma na qual se vai adicionar ou retirar algo. <\/p>\n\n\n\n
Logo ap\u00f3s, se aplica na c\u00e9lula de interesse (seja uma bact\u00e9ria, c\u00e9lula de planta ou fungo, como no LEBIMO) v\u00e1rias c\u00f3pias do RNAg, Cas9 e \u2014 nos casos em que se tem interesse em acrescentar algo \u2014 o gene de interesse. Por fim, o RNAg se une \u00e0 Cas9 e indica a esta a sequ\u00eancia complementar a ele do genoma, que ent\u00e3o \u00e9 cortada. Depois, o pr\u00f3prio sistema de reparo de DNA da c\u00e9lula \u201cconserta\u201d essa regi\u00e3o que foi cortada. Nesse ponto, existem algumas possibilidades de resultado final:<\/p>\n\n\n\n
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- Se o interesse era remover uma muta\u00e7\u00e3o:<\/strong> o sistema de reparo acrescenta os nucleot\u00eddeos que foram cortados, possivelmente consertando o erro derivado da muta\u00e7\u00e3o.<\/li>\n\n\n\n
- Se o interesse era retirar um gene inteiro:<\/strong> utilizam-se dois RNAg, sendo que um vai mirar o \u201ccorte\u201d no come\u00e7o do gene e outro no \u201cfinal\u201d deste; depois disso, o sistema de reparo da c\u00e9lula \u201creliga\u201d as extremidades das fitas de DNA, ignorando o gene que foi cortado fora.<\/li>\n\n\n\n
- Se o interesse era inserir um gene:<\/strong> al\u00e9m do RNAg e da Cas9, deve-se adicionar a sequ\u00eancia de DNA a ser inserida; ap\u00f3s a Cas9 cortar o DNA, o sistema de reparo da c\u00e9lula vai incorporar o gene de interesse no genoma, ligando cada extremidade do DNA \u00e0s extremidades da sequ\u00eancia inserida no meio.<\/li>\n<\/ul>\n\n\n\n
Assim, utilizando o sistema CRISPR\/Cas9, pesquisadores conseguem reparar, silenciar e reprimir genes, entre diversas outras altera\u00e7\u00f5es gen\u00e9ticas, necess\u00e1rias para suas pesquisas.<\/p>\n\n\n\n
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Quais s\u00e3o as aplica\u00e7\u00f5es da CRISPR-Cas9?<\/strong><\/h2>\n\n\n\n
Como j\u00e1 comentado, o sistema da CRISPR-Cas9 foi originalmente proposto como um mecanismo \u201cimune\u201d de bact\u00e9rias contra a infec\u00e7\u00e3o por v\u00edrus. Assim, por si s\u00f3, este j\u00e1 se mostra uma ferramenta naturalmente promissora para o tratamento de doen\u00e7as infecciosas, como hepatite B e HIV. Al\u00e9m disso, o CRISPR-Cas9 vem sendo estudado por diversos grupos de pesquisa como ferramenta para tratamento de diversas doen\u00e7as gen\u00e9ticas, como c\u00e2ncer e doen\u00e7as autoimunes e monog\u00eanicas (ou seja, causadas por um \u00fanico gene).<\/p>\n\n\n\n
No caso do HIV, v\u00e1rios estudos com c\u00e9lulas-tronco j\u00e1 demonstram o potencial protetor de um gene chamado CCR5 contra o v\u00edrus HIV; altera\u00e7\u00f5es nesse gene utilizando a CRISPR-Cas9 garantiram uma maior resist\u00eancia \u00e0 infec\u00e7\u00e3o pelo v\u00edrus. Entretanto, nem tudo \u00e9 perfeito e ainda existem diversas discuss\u00f5es \u00e9ticas quanto a pesquisas desse g\u00eanero em seres humanos. <\/p>\n\n\n\n
Por exemplo, em 2018, um cientista chin\u00eas anunciou que duas beb\u00eas g\u00eameas nasceram ap\u00f3s terem sido geneticamente modificadas utilizando-se da t\u00e9cnica de CRISPR\/Cas9. Ainda quando eram embri\u00f5es, ambas tiveram seu genoma modificado, especificamente o gene CCR5, para que fossem resistentes a infec\u00e7\u00e3o pelo HIV. Durante o an\u00fancio, o cientista explicou que os beb\u00eas nasceram saud\u00e1veis e sem qualquer sequela. Contudo, a edi\u00e7\u00e3o gen\u00e9tica de embri\u00f5es \u00e9 um assunto controverso e precisa ser muito analisado, principalmente em suas camadas \u00e9ticas. O caso gerou indigna\u00e7\u00e3o na comunidade cient\u00edfica global devido aos riscos desconhecidos e \u00e0 falta de transpar\u00eancia, resultando na condena\u00e7\u00e3o criminal do pesquisador e impulsionando debates rigorosos sobre a regulamenta\u00e7\u00e3o da edi\u00e7\u00e3o gen\u00e9tica em humanos.<\/p>\n\n\n\n
No cen\u00e1rio de modifica\u00e7\u00f5es de fungos e outros organismos para biomanufatura e outros bioprocessos, como acontece no LEBIMO, o uso de CRISPR-Cas9 j\u00e1 est\u00e1 muito mais naturalizado e frequente, sendo utilizada no cotidiano para a exclus\u00e3o, inclus\u00e3o ou altera\u00e7\u00e3o de genes de interesse, como prote\u00ednas recombinantes para produ\u00e7\u00e3o de antibi\u00f3ticos, biocombust\u00edveis e suplementos alimentares.<\/p>\n\n\n\n
E quais s\u00e3o as limita\u00e7\u00f5es da CRISPR-Cas9?<\/strong><\/h2>\n\n\n\n
Como comentei logo acima, a edi\u00e7\u00e3o de genoma (principalmente o humano) levanta diversas quest\u00f5es \u00e9ticas que s\u00e3o bastante importantes. Ao redor de todo o mundo, diversos comit\u00eas de \u00e9tica, institui\u00e7\u00f5es de pesquisa e governos t\u00eam discutido a aplica\u00e7\u00e3o da edi\u00e7\u00e3o de DNA em embri\u00f5es humanos, em parte pela possibilidade de s\u00e9rios efeitos sociais (como aumento de preconceito e estigmatiza\u00e7\u00e3o) e em parte por n\u00e3o se entender as consequ\u00eancias biol\u00f3gicas a longo prazo ap\u00f3s a modifica\u00e7\u00e3o gen\u00e9tica de embri\u00f5es. Para al\u00e9m da nossa esp\u00e9cie, essa discuss\u00e3o tamb\u00e9m acontece, muito voltada para a preserva\u00e7\u00e3o de genomas \u201cnaturais\u201d com o crescente avan\u00e7o de linhagens com melhorias gen\u00e9ticas focadas no aumento da produtividade; contudo, o n\u00famero e a intensidade dessas discuss\u00f5es s\u00e3o menores.<\/p>\n\n\n\n
Ainda assim, a CRISPR-Cas9 \u00e9 a grande esperan\u00e7a para a medicina atual, com foco no desenvolvimento de novas terapias para o tratamento de doen\u00e7as gen\u00e9ticas. Entretanto, ainda s\u00e3o necess\u00e1rias muitas pesquisas para avaliar a efici\u00eancia e, principalmente, a seguran\u00e7a do uso dessa t\u00e9cnica em humanos, inclusive em adultos.<\/p>\n\n\n\n
Outros estudos tamb\u00e9m mostraram que o sistema CRISPR\/Cas9 pode errar o alvo indicado pelo RNAg, acabando por editar outras regi\u00f5es do genoma, criando ainda mais problemas por gerar novos erros no DNA. Esses eventos s\u00e3o chamados de off-targets<\/em> (ou \u201cfora do alvo\u201d em portugu\u00eas), sendo um fator limitante e importante no uso da CRISPR-Cas9 em humanos. Por isso, ainda s\u00e3o necess\u00e1rios muitos anos de pesquisa para entender como esse sistema atua no nosso organismo e quais s\u00e3o as consequ\u00eancias de editar nosso genoma.<\/p>\n\n\n\n
A tecnologia CRISPR-Cas9 representa um marco na biologia moderna, oferecendo ferramentas sem precedentes para a medicina e a biotecnologia. No cen\u00e1rio da biomanufatura, a capacidade de inserir, alterar e remover genes abre novos caminhos para a pesquisa. Mas, como a simples remo\u00e7\u00e3o de um gene pode impulsionar a produ\u00e7\u00e3o industrial? No pr\u00f3ximo artigo, exploraremos como a dele\u00e7\u00e3o estrat\u00e9gica de genes est\u00e1 otimizando bioprocessos e transformando a forma como produzimos materiais sustent\u00e1veis.<\/p>\n\n\n\n
- Se o interesse era retirar um gene inteiro:<\/strong> utilizam-se dois RNAg, sendo que um vai mirar o \u201ccorte\u201d no come\u00e7o do gene e outro no \u201cfinal\u201d deste; depois disso, o sistema de reparo da c\u00e9lula \u201creliga\u201d as extremidades das fitas de DNA, ignorando o gene que foi cortado fora.<\/li>\n\n\n\n
- Se o interesse era remover uma muta\u00e7\u00e3o:<\/strong> o sistema de reparo acrescenta os nucleot\u00eddeos que foram cortados, possivelmente consertando o erro derivado da muta\u00e7\u00e3o.<\/li>\n\n\n\n