Se o genoma carrega todas as informa\u00e7\u00f5es necess\u00e1rias para um organismo viver no seu ambiente, por que apagar genes pode ser ben\u00e9fico em algumas situa\u00e7\u00f5es, como na biomanufatura? No \u00faltimo texto da nossa s\u00e9rie, conversamos sobre a principal tecnologia da atualidade para a modifica\u00e7\u00e3o gen\u00e9tica, a CRISPR-Cas9. Hoje, iremos discutir como a dele\u00e7\u00e3o estrat\u00e9gica de genes, aliada \u00e0 modifica\u00e7\u00e3o destes, pode auxiliar na produ\u00e7\u00e3o de bioprodutos.<\/p>\n\n\n\n
Bem, sabemos que o genoma de um organismo, seja RNA ou DNA, \u00e9 o conjunto de mol\u00e9culas que carrega as informa\u00e7\u00f5es necess\u00e1rias para produzir todas as prote\u00ednas (e outras mol\u00e9culas) que s\u00e3o necess\u00e1rias para a vida existir. Vamos considerar a nossa esp\u00e9cie: temos 23 pares de fitas de DNA, com cada uma dessas contendo uma parte da informa\u00e7\u00e3o gen\u00e9tica para gerar um ser humano. <\/p>\n\n\n\n
O genoma \u00e9 formado por sequ\u00eancias de nucleot\u00eddeos (as famosas \u201cletrinhas\u201d) que codificam uma ou mais prote\u00ednas em espec\u00edfico. Essa sequ\u00eancia codificadora – junto com v\u00e1rios outros elementos que n\u00e3o v\u00eam ao caso aqui – \u00e9 chamada de gene. Aqui necessito fazer uma pequena ressalva para os bi\u00f3logos de plant\u00e3o: sim, sei que essa explica\u00e7\u00e3o \u00e9 terrivelmente simplista, e que a defini\u00e7\u00e3o de gene \u00e9 alvo de constantes disputas e debates nas ci\u00eancias biol\u00f3gicas, variando tanto no tempo quanto na \u00e1rea de estudo. Entretanto, como o foco desse texto n\u00e3o \u00e9 isso, vou me ater a essa defini\u00e7\u00e3o.<\/p>\n\n\n\n
A dele\u00e7\u00e3o ocorre quando h\u00e1 a remo\u00e7\u00e3o, inativa\u00e7\u00e3o ou perda integral ou parcial de um gene. Esses eventos podem acontecer tanto naturalmente, por meio de uma muta\u00e7\u00e3o, quanto durante a divis\u00e3o celular ou mesmo artificialmente, utilizando a t\u00e9cnica de CRISPR-Cas9, como conversamos anteriormente. O ponto importante \u00e9 que, normalmente, a dele\u00e7\u00e3o vem acompanhada da perda de fun\u00e7\u00e3o desse gene. Embora pare\u00e7a contraintuitivo que perder informa\u00e7\u00e3o seja vantajoso, na biotecnologia industrial essa estrat\u00e9gia funciona como a simplifica\u00e7\u00e3o de um maquin\u00e1rio: ao remover pe\u00e7as redundantes, a c\u00e9lula economiza energia para focar na produ\u00e7\u00e3o do bioproduto desejado.<\/p>\n\n\n\n
Genes podem codificar os mais diferentes tipos de prote\u00ednas, e elas mesmas podem ser classificadas de diferentes formas. Para compreender o impacto de deletar um gene, precisamos olhar para as prote\u00ednas que ele codifica. Na c\u00e9lula, elas desempenham fun\u00e7\u00f5es t\u00e3o diversas quanto os componentes de uma cidade: atuam como tijolos estruturais que d\u00e3o forma \u00e0 c\u00e9lula, mensageiras qu\u00edmicas (como os horm\u00f4nios) que transmitem sinais e defensoras contra invasores (como os anticorpos). Entretanto, no cen\u00e1rio da biomanufatura, dois tipos de prote\u00ednas s\u00e3o protagonistas: as enzimas, que atuam como aceleradoras de rea\u00e7\u00f5es qu\u00edmicas, e as proteases, que atuam como \u201ctrituradores moleculares\u201d, encarregadas de degradar outras prote\u00ednas.<\/p>\n\n\n\n
\u00c9 preciso tamb\u00e9m mencionar que essas fun\u00e7\u00f5es n\u00e3o s\u00e3o mutuamente exclusivas. Uma prote\u00edna normalmente tem mais de uma fun\u00e7\u00e3o e existem muitas outras que n\u00e3o mencionei. Por exemplo, os anticorpos s\u00e3o tanto prote\u00ednas de defesa quanto de sinaliza\u00e7\u00e3o, e h\u00e1 um tipo de anticorpo que \u00e9 uma prote\u00edna de membrana. As fosfoquinases s\u00e3o enzimas cuja principal fun\u00e7\u00e3o \u00e9 atuar como prote\u00ednas sinalizadoras. Al\u00e9m disso, em muitos casos, \u00e9 necess\u00e1rio combinar v\u00e1rias prote\u00ednas para que elas desempenhem suas fun\u00e7\u00f5es. <\/p>\n\n\n\n
No contexto de biomanufatura que venho descrevendo nas \u00faltimas semanas, a melhor pergunta a fazer n\u00e3o \u00e9 \u201cpor que deletar genes\u201d, mas sim \u201cquais genes deletar\u201d. Bem, vamos pensar em tudo o que j\u00e1 conversamos sobre isso at\u00e9 o momento e tomar como base as pesquisas realizadas no projeto BEYOND do LEBIMO. <\/p>\n\n\n\n
Ao desenvolver um processo de biomanufatura em que os pesquisadores t\u00eam interesse – por exemplo, para produzir um medicamento – eles colocam o seu organismo produtor (no caso, o fungo Aspergillus oryzae<\/em>) em um biorreator com todos os nutrientes que este precisa e com as melhores condi\u00e7\u00f5es ambientais poss\u00edveis para ele crescer e produzir o bioproduto que desejam. Dentre os nutrientes necess\u00e1rios est\u00e1 a glicose, um tipo de a\u00e7\u00facar mais simples que as c\u00e9lulas do fungo utilizam para produzir energia.<\/p>\n\n\n\n Na natureza, o A. oryzae<\/em> possui um conjunto de enzimas que utiliza para quebrar o amido (um tipo de a\u00e7\u00facar mais complexo) em pequenas unidades de glicose. Essas enzimas, como comentado anteriormente, s\u00e3o chamadas de amilases. No contexto da biomanufatura, em que os pesquisadores fornecem a glicose \u201cpronta\u201d ao fungo, este – teoricamente – n\u00e3o precisaria mais produzir amilases. Contudo, isso n\u00e3o \u00e9 o que acontece. As c\u00e9lulas f\u00fangicas continuam produzindo esta enzima, seguindo as ordens do seu genoma. Nesse sentido, os cientistas se perguntaram:<\/p>\n\n\n\n E o que foi visto \u00e9 que aparentemente<\/strong> sim! Tecnicamente, os genes das amilases (e de outras prote\u00ednas) n\u00e3o foram completamente deletados. Na verdade, o que os pesquisadores fizeram foi retirar a parte desses genes que codifica a prote\u00edna – mantendo quase todas as outras partes relacionadas \u00e0 regula\u00e7\u00e3o desse processo – e colocar em seu lugar a sequ\u00eancia codificadora para as prote\u00ednas recombinantes de interesse. No final desse processo, o que os cientistas viram \u00e9 que a produ\u00e7\u00e3o de prote\u00ednas recombinantes n\u00e3o foi afetada, assim como o funcionamento do resto da c\u00e9lula.\u00a0<\/p>\n\n\n\n A estrat\u00e9gia se assemelhou a uma reforma em uma linha de montagem industrial. Ao inv\u00e9s de construir uma nova f\u00e1brica, os pesquisadores aproveitaram a infraestrutura de regula\u00e7\u00e3o e produ\u00e7\u00e3o proteica j\u00e1 presente no fungo. Ao remover apenas a sequ\u00eancia de instru\u00e7\u00f5es gen\u00e9ticas que moldam a amilase e inserir, no mesmo local, o molde da prote\u00edna de interesse (como um biof\u00e1rmaco), os pesquisadores \u201cenganaram\u201d a c\u00e9lula. O fungo passou a produzir o medicamento utilizando os mesmos comandos que usava antes para fabricar suas pr\u00f3prias enzimas.<\/p>\n\n\n\n Atualmente, essa \u00e9 uma das estrat\u00e9gias que est\u00e1 sendo estudada para a otimiza\u00e7\u00e3o da produ\u00e7\u00e3o em bioprocessos. Por exemplo, no projeto BEYOND, alguns pesquisadores est\u00e3o estudando como a dele\u00e7\u00e3o de genes – da amilase, de proteases e de prote\u00ednas envolvidas no metabolismo da celulose – pode influenciar a produ\u00e7\u00e3o de prote\u00ednas recombinantes em Aspergillus oryzae<\/em>. A ideia \u00e9 que, se as c\u00e9lulas pararem de produzir essas prote\u00ednas, haver\u00e1 tanto um aumento da disponibilidade de recursos celulares para a s\u00edntese de prote\u00ednas recombinantes de interesse quanto uma redu\u00e7\u00e3o da chance de que estas sejam destru\u00eddas pela pr\u00f3pria c\u00e9lula. <\/p>\n\n\n\n Contudo, esse processo de deletar genes n\u00e3o \u00e9 t\u00e3o simples quanto parece. A primeira dificuldade, at\u00e9 alguns anos atr\u00e1s, era a tecnologia para isso; entretanto, esse ponto foi parcialmente superado pela CRISPR-Cas9. Uma outra dificuldade \u00e9 saber qual candidato a gene \u00e9 uma boa escolha para ser deletado, pois raramente um gene opera de forma isolada (como somente na produ\u00e7\u00e3o de uma prote\u00edna); frequentemente, um \u00fanico gene influencia a regula\u00e7\u00e3o de v\u00e1rios outros, inclusive em pontos distantes do genoma. <\/p>\n\n\n\n Al\u00e9m disso, como comentado anteriormente, as prote\u00ednas podem desempenhar mais de uma fun\u00e7\u00e3o. Dessa forma, \u00e9 preciso considerar n\u00e3o s\u00f3 o impacto da dele\u00e7\u00e3o do gene, como tamb\u00e9m o impacto da dele\u00e7\u00e3o da prote\u00edna no conjunto proteico da c\u00e9lula. Por exemplo, genes que codificam prote\u00ednas relacionadas ao metabolismo de subst\u00e2ncias presentes na natureza, mas n\u00e3o em um biorreator (como a amilase), s\u00e3o bons candidatos. Mas esses casos s\u00e3o raros e ainda \u00e9 preciso realizar muitos testes antes de se considerar que a aus\u00eancia de um gene e de uma prote\u00edna realmente ser\u00e1 ben\u00e9fica para um bioprocesso.<\/p>\n\n\n\n Outros candidatos \u00e0 dele\u00e7\u00e3o s\u00e3o as proteases, enzimas envolvidas na degrada\u00e7\u00e3o de prote\u00ednas. Embora indesejadas por degradarem nosso produto de interesse, elas desempenham pap\u00e9is vitais na reciclagem de componentes celulares. Remover esses ‘trituradores’ sem comprometer a viabilidade do fungo exige um ajuste metab\u00f3lico muito preciso. No pr\u00f3ximo texto, vamos entender qual o balan\u00e7o que deve ser feito ao se trabalhar com as proteases em bioprocessos (e por que, muitas vezes, elas s\u00e3o problem\u00e1ticas).<\/p>\n\n\n\n“j\u00e1 que estamos dando a fonte de energia para os fungos, e se trocarmos os genes das amilases pelos genes da prote\u00edna recombinante que temos interesse? Ser\u00e1 que essa ser\u00e1 produzida no lugar sem afetar todo o resto da biologia da c\u00e9lula?\u00a0“<\/em><\/strong><\/h4>\n\n\n\n
Isso parece bem \u00fatil! Mas a dele\u00e7\u00e3o de genes pode causar algum problema \u00e0s c\u00e9lulas?<\/strong><\/h2>\n\n\n\n