{"id":110,"date":"2010-07-24T16:39:06","date_gmt":"2010-07-24T19:39:06","guid":{"rendered":"http:\/\/scienceblogs.com.br\/quimicaviva\/2010\/07\/fatores_reguladores_da_virulen\/"},"modified":"2010-07-24T16:39:06","modified_gmt":"2010-07-24T19:39:06","slug":"fatores_reguladores_da_virulen","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.blogs.unicamp.br\/quimicaviva\/2010\/07\/24\/fatores_reguladores_da_virulen\/","title":{"rendered":"Fatores reguladores da virul\u00eancia de Staphylococcus aureus"},"content":{"rendered":"

Antibi\u00f3ticos, bact\u00e9rias, infec\u00e7\u00f5es, microrganismos s\u00e3o alguns dos assuntos que mais gosto, como meus leitores j\u00e1 devem ter percebido. J\u00e1 foram postados v\u00e1rios textos neste blog sobre esta tem\u00e1tica. Tamb\u00e9m j\u00e1 escrevi aqui sobre a bact\u00e9ria patog\u00eanica Staphylococcus aureus<\/em>, que pode ser extremamente nefasta, principalmente se a infec\u00e7\u00e3o por esta n\u00e3o for adequadamente tratada.S. aureus<\/em>, como \u00e9 conhecida, \u00e9 uma bact\u00e9ria danada. Ela possui v\u00e1rios mecanismos de virul\u00eancia, como prote\u00ednas que atuam na ades\u00e3o desta bact\u00e9ria a superf\u00edcies e na invas\u00e3o de tecidos de hospedeiros, exoprote\u00ednas que atuam contra mecanismos de imunidade, al\u00e9m de tamb\u00e9m possuir toxinas que causam hem\u00f3lise (destrui\u00e7\u00e3o dos hem\u00f3citos, ou gl\u00f3bulos vermelhos) e que formam poros em membranas, permitindo o \u201cvazamento\u201d de \u00edons e outras mol\u00e9culas pequenas de c\u00e9lulas de hospedeiros. Para que cause infec\u00e7\u00e3o, \u00e9 necess\u00e1rio que os fatores de virul\u00eancia de S. aureus<\/em> atuem de forma coordenada, at\u00e9 mesmo de maneira redundante, de tal forma que se um de seus fatores de virul\u00eancia for afetado, os outros continuar\u00e3o ativos.<\/p>\n

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\nStaphylococcus aureus<\/em>
\nDescobriu-se que S. aureus<\/em> tem um gene regulador de virul\u00eancia, denominado agr <\/em>(accessory gene regulator). At\u00e9 pouco tempo atr\u00e1s se sabia que a express\u00e3o do gene agr <\/em>era regulada por um sinalizador qu\u00edmico. E se sabia de que tipo era este sinalizador: uma mol\u00e9cula pequena, da classe dos metabolitos secund\u00e1rios. Tamb\u00e9m se descobriu que, apesar do gene agr <\/em>ter uma grande import\u00e2ncia na regula\u00e7\u00e3o da virul\u00eancia de S. aureus<\/em>, este gene n\u00e3o \u00e9 essencial para a express\u00e3o da virul\u00eancia. S\u00e3o conhecidos isolados cl\u00ednicos (de hospitais) de S. aureus<\/em> desprovidos do gene agr<\/em>.Recentemente, pesquisadores realizaram uma extensa an\u00e1lise do material gen\u00e9tico (genoma) de S. aureus<\/em>, de maneira a verificar a presen\u00e7a de genes reguladores da bioss\u00edntese (processo enzim\u00e1tico de v\u00e1rias etapas que \u00e9 respons\u00e1vel pela forma\u00e7\u00e3o das mol\u00e9culas biol\u00f3gicas, como prote\u00ednas, a\u00e7\u00facares, DNA, RNA, e tamb\u00e9m de metabolitos secund\u00e1rios) de pept\u00eddeos n\u00e3o-riboss\u00f4micos exclusivos de S. aureus<\/em>. Analisando o genoma desta maneira, \u00e9 poss\u00edvel se detectar a presen\u00e7a de genes que regulam a bioss\u00edntese de subst\u00e2ncias espec\u00edficas, e propor a estrutura qu\u00edmica das mesmas, uma vez que estes genes coordenam a a\u00e7\u00e3o de enzimas que atuam de maneira bem estabelecida. Foram analisados 50 genomas de S. aureus<\/em>, e identificado um agregado de genes (gene cluster) respons\u00e1vel pela bioss\u00edntese de pept\u00eddeos n\u00e3o-ribossomais (ou seja, pept\u00eddeos que n\u00e3o s\u00e3o formados nos ribossomos, como s\u00e3o a grande maioria das prote\u00ednas, pept\u00eddeos muito grandes) ainda desconhecidos. O agregado de genes mostrou ter um gene de 7,17 Kb (1 Kb = 1000 bases nucl\u00e9icas, que formam o DNA), que ocupa apenas 0,25% do genoma de S. aureus<\/em>.<\/p>\n

Este agregado de genes regula a forma\u00e7\u00e3o de uma sintetase de pept\u00eddeos n\u00e3o-ribossomais (NRPS, non-ribossomal peptide synthetase) de 2389 amino\u00e1cidos. Esta NRPS mostrou ter s\u00edtios que atuam na forma\u00e7\u00e3o de um dipept\u00eddeo (um derivado de dois amino\u00e1cidos) com estrutura muito peculiar: \u00e9 formado a partir dos amino\u00e1cidos valina e tirosina, que se condensam e d\u00e3o origem a uma estrutura c\u00edclica, de massa molecular de 262,17 u.m.a.(u.m.a. = unidade de massa at\u00f4mica). Ou seja, a partir da an\u00e1lise do genoma de S. aureus<\/em>, foi poss\u00edvel se encontrar genes que regulam a forma\u00e7\u00e3o deste dipept\u00eddeo, cuja estrutura p\u00f4de ser predita a partir dos resultados obtidos da an\u00e1lise do genoma.<\/p>\n

Por\u00e9m, era necess\u00e1rio que esta predi\u00e7\u00e3o fosse confirmada.<\/p>\n

Desta forma, os autores deste estudo cresceram S. aureus<\/em> em meio de cultura, extra\u00edram o meio de cultura com solventes org\u00e2nicos e analisaram os extratos do meio de cultura por cromatografia l\u00edquida (HPLC, high-performance liquid chromatography) acoplada a um detector de espectrometria de massas. Desta forma, para cada subst\u00e2ncia separada foi poss\u00edvel obter um espectro de massas, que indica a massa molecular da forma protonada das subst\u00e2ncias presentes no meio de cultura de S. aureus<\/em>. Estas an\u00e1lises indicaram a presen\u00e7a de duas subst\u00e2ncias (dentre outras) no extrato org\u00e2nico do meio de cultura de S. aureus<\/em>: uma de massa 262 e outra de massa 246. As duas mostraram ser muito parecidas pelo fato de serem pouco separadas na an\u00e1lise por HPLC, e tamb\u00e9m por apresentarem espectro no ultravioleta muito similar. Ou seja, talvez estas subst\u00e2ncias apresentassem estruturas muito parecidas, e tivessem uma bioss\u00edntese comum.<\/p>\n

Esta hip\u00f3tese foi confirmada ap\u00f3s a obten\u00e7\u00e3o das subst\u00e2ncias puras, uma separada da outra. Ap\u00f3s isoladas, puderam ser analisadas por v\u00e1rias t\u00e9cnicas espectrosc\u00f3picas, principalmente por diferentes experimentos de resson\u00e2ncia magn\u00e9tica nuclear (RMN). Estas an\u00e1lises indicaram que um dos dipept\u00eddeos isolados era formado por tirosina e valina (aureusimina A), e o outro por fenilalanina e valina (aureusimina B). A diferen\u00e7a entre os dois \u00e9 de apenas um \u00e1tomo de oxig\u00eanio.<\/p>\n

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\nPara confirmar que estes dois dipept\u00eddeos eram realmente biossintetizados por S. aureus<\/em>, o gene ausA<\/em>, supostamente respons\u00e1vel pela regula\u00e7\u00e3o da bioss\u00edntese destas duas subst\u00e2ncias, foi substitu\u00eddo por um gene artificial. E S. aureus<\/em> n\u00e3o mais produziu as aureusiminas.Em seguida, foram feitos testes com as duas subst\u00e2ncias (aureusiminas A e B) para verificar como estas influenciavam na express\u00e3o do gene agr<\/em>, que controla a virul\u00eancia de S. aureus<\/em>. Observou-se que a substitui\u00e7\u00e3o do gene ausA<\/em> de S. aureus<\/em>, respons\u00e1vel pela bioss\u00edntese das auresiminas, por um gene artificial alterou completamente o padr\u00e3o de express\u00e3o do gene agr<\/em>, respons\u00e1vel pela virul\u00eancia. Observou-se diminui\u00e7\u00e3o na forma\u00e7\u00e3o de prote\u00ednas imunomodulat\u00f3rias, de prote\u00ednas de ades\u00e3o, bem como de prote\u00ednas l\u00edticas (que promovem o rompimento de membranas) e de citotoxinas (toxinas de c\u00e9lulas). Enquanto tais prote\u00ednas mostraram ter sua produ\u00e7\u00e3o estimulada na presen\u00e7a das aureusiminas, na aus\u00eancia destas subst\u00e2ncias as prote\u00ednas virulentas mostraram ser produzidas em quantidades muito menores.<\/p>\n

Claramente as aureusiminas mostraram atuar na regula\u00e7\u00e3o das prote\u00ednas participantes do processo de virul\u00eancia de S. aureus<\/em>.<\/p>\n

Normalmente, S. aureus<\/em> \u201coriginal\u201d, sem ter seu genoma alterado, promove hem\u00f3lise. Quando o gene ausA<\/em> foi suprimido, a hem\u00f3lise promovida por S. aureus<\/em> sem este gene tamb\u00e9m foi suprimida. Quando se adicinou as aureusiminas no meio de crescimento de S. aureus<\/em> com seu genoma alterado (com o gene ausA<\/em> deletado), voltou-se a observar a hem\u00f3lise. Claramente as aureusiminas participam diretamente da ativa\u00e7\u00e3o dos processos de virul\u00eancia de S. aureus<\/em>.<\/p>\n

E mais: quando camundongos sadios foram infectados com S. aureus<\/em> \u201coriginal\u201d (sem ter seu genoma alterado), os bichinhos apresentaram grande quantidade de unidades formadoras de col\u00f4nia (um indicativo de prolifera\u00e7\u00e3o bacteriana) em seus rins, f\u00edgado, ba\u00e7o e cora\u00e7\u00e3o. Quando os camundongos foram infectados com S. aureus<\/em> mutada, com o gene ausA<\/em> suprimido, observou-se que os rins apresentaram grau de infec\u00e7\u00e3o, mas os outros tr\u00eas \u00f3rg\u00e3os muito menos, principalmente o cora\u00e7\u00e3o (praticamente sem infec\u00e7\u00e3o). Ou seja, a inibi\u00e7\u00e3o da bioss\u00edntese das aureusiminas levou a um grau de infec\u00e7\u00e3o virulenta muito menor.<\/p>\n

A descoberta que as aureusiminas controlam a virul\u00eancia de S. aureus<\/em> abre um enorme conjunto de possibilidades para o desenvolvimento de novas formas de tratamento de infec\u00e7\u00f5es por esta bact\u00e9ria. Por exemplo, a eventual descoberta de inibidores da bioss\u00edntese das aureusiminas pode significar a aboli\u00e7\u00e3o do uso de antibi\u00f3ticos para o tratamento de infec\u00e7\u00f5es por S. aureus<\/em>. Embora tal perspectiva possa parecer distante, tudo depende do esfor\u00e7o de pesquisadores acad\u00eamicos e de ind\u00fastrias farmac\u00eauticas s\u00e9rias. O mecanismo de a\u00e7\u00e3o de tais agentes inibidores da virul\u00eancia de S. aureus<\/em> seria completamente diferente do mecanismo de a\u00e7\u00e3o dos antibi\u00f3ticos. Isso porque os inibidores da bioss\u00edntese das aureusiminas interferem no processo bioqu\u00edmico de forma\u00e7\u00e3o destas subst\u00e2ncias, muito mais dif\u00edcil de sofrer uma muta\u00e7\u00e3o ben\u00e9fica para continuar promovendo a virul\u00eancia. Desta forma, n\u00e3o seria mais necess\u00e1rio utilizar antibi\u00f3ticos, dos quais as bact\u00e9rias adquirem resist\u00eancia (atrav\u00e9s de muta\u00e7\u00f5es) em poucas gera\u00e7\u00f5es.<\/p>\n

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\nInfec\u00e7\u00e3o causada por S. aureus<\/em> (nojenta!)
\nEmbora o trabalho realizado com S. aureus<\/em> pare\u00e7a muito complicado, realmente n\u00e3o \u00e9. As atuais ferramentas bioqu\u00edmicas permitem a realiza\u00e7\u00e3o de um trabalho deste em tempo relativamente curto. Na verdade, os autores mencionam um trabalho publicado em 2008 como fonte das informa\u00e7\u00f5es preliminares nas quais se basearam para realizar seu estudo. A refer\u00eancia original indica que este trabalho (Novick e Geisinger) foi publicado on-line em agosto de 2008. Ou seja, o estudo realizado com S. aureus<\/em> levou, no m\u00e1ximo, menos de dois anos para ser desenvolvido. Uma boa id\u00e9ia e abordagens e estrat\u00e9gias de trabalho bem delineadas levaram \u00e0 publica\u00e7\u00e3o de um artigo extramemente relevante na Science<\/em>, uma vez que as infec\u00e7\u00f5es causadas por S. aureus<\/em> s\u00e3o consideradas um dos maiores problemas de sa\u00fade p\u00fablica no mundo.O que certamente fez a diferen\u00e7a para um trabalho deste ter sido feito em t\u00e3o pouco tempo? Acesso a instrumenta\u00e7\u00e3o e aos materiais (reagentes, linhagens bacterianas, camundongos) necess\u00e1rios para o desenvolvimento deste projeto. Sem entraves, sem burocracia, sem demora, sem falta de dinheiro.<\/p>\n

\"ResearchBlogging.org\"<\/a><\/span>Wyatt, M., Wang, W., Roux, C., Beasley, F., Heinrichs, D., Dunman, P., & Magarvey, N. (2010). Staphylococcus aureus Nonribosomal Peptide Secondary Metabolites Regulate Virulence Science, 329<\/span> (5989), 294-296 DOI: 10.1126\/science.1188888<\/a><\/span>
\n\"ResearchBlogging.org\"<\/a><\/span>Novick, R., & Geisinger, E. (2008). Quorum Sensing in Staphylococci Annual Review of Genetics, 42<\/span> (1), 541-564 DOI: 10.1146\/annurev.genet.42.110807.091640<\/a><\/span><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

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