Para quem não leu, antes de ler este post, vale a pena ler o post anterior do interruptor para entender alguns conceitos básicos. Um contador é um componente central para circuitos digitais e de computação que guarda (e às vezes mostra) o número de eventos ou processos que ocorreram.

Neste trabalho é descrita a construção de contadores sintéticos para bactérias. Após a construção de um dispositivo aparentemente simples, Friedland et al. (2009) sofisticam bastante a construção do regulador para garantir uma resposta (contagem) robusta.

O primeiro contador descrito pelo trabalho é o “contador riborregulado por uma cascada transcricional” (riboregulated transcriptional cascade counter). Ele conta pulsos de arabinose no meio de cultura utilizando como sinal uma proteína luminescente (GFP). São riborregulados porque o taRNA (controlado por um promotor sensível a arabinose) se liga a cr e impede a formação de um grampo (pareamento) entre RBS e cr. Dessa maneira,  permite o reconhecimento do RBS (sítio de ligação do ribossomo) pelo ribossomo e a tradução do gene (ver Figura abaixo). O interessante é que a transcrição do taRNA é regulada por um promotor sensível a arabinose. Assim, no primeiro pulso de arabinose, ocorre a transcrição de taRNA que permite a tradução da RNA polimerase T7. Após o primeiro pulso a arabinose e taRNA são degradados. No segundo pulso ocorre, da mesma maneira, a transcrição da RNA polimerase T3 através do promotor PT7 que é especificamente reconhecido pela RNA polimerase T7. No terceiro pulso, ocorre também através da mediação de taRNA e da polimerase T3, a transcrição de GFP. Dessa maneira, a bactéria responde aos 3 pulsos de arabinose com um sinal luminescente.

Porém foi verificado um vazamento de expressão de GFP nos pulsos intermediários, além disso, demonstrou-se que se o pulso de arabinose não é dado a uma intensidade e frequência corretas, o contador  não funciona direito. Isto provavelmente ocorre devido aos limites cinéticos intrínsecos envolvendo os tempos de transcrição e degradação de mRNA.

Por esse motivo, um segundo (e muito mais bacana) contador foi construído, chamado contador de cascada de DNA invertase (DNA invertase cascade counter). Que basicamente acoplou ao modelo anterior um controle de invertases na região promotora.

Uma invertase é uma enzima muito interessante, as enzimas Cre, por ex., reconhecem determinadas sequências de DNA que flanqueiam uma determinada região de DNA e invertem a orientação dessa região. Essa enzima é utilizada para ativar os promotores através da inversão de sua orientação (ver Figura abaixo). Com essa construção foi possível obter um controle muito maior da expressão de GFP, ocorrendo, após o terceiro pulso, uma expressão muito maior de GFP. Este contador agora é muito mais robusto em relação à variação de tempo entre os pulsos de arabinose, podendo contar pulsos realizados em intervalos de tempo de 2 a 12 horas. Este novo dispositivo, além de mostrar o sinal luminescente, grava a informação no DNA através das recombinações.

Os autores foram ainda mais longe, trocaram o promotor de sensibilidade a arabinose por promotores capazes de responder a diferentes sinais. Dessa maneira, o dispositivo pode ser programado para gravar e responder diferentes sinais na ordem desejada. Incrível!

Esse dispositivo genético pode ser programado para diferentes funções a fim de sincronizar diferentes sinais para uma determinada resposta. Dependendo dos sinais acoplados ao dispositivo, estes mecanimos podem ser utilizados para biosensores, biorremediação ou na medicina.

Friedland, A., Lu, T., Wang, X., Shi, D., Church, G., & Collins, J. (2009). Synthetic Gene Networks That Count Science, 324 (5931), 1199-1202 DOI: 10.1126/science.1172005