Sequenciamento pelo Oxford Nanopore

O Oxford Nanopore é uma tecnologia para sequenciamento de nucleotídeos, em desenvolvimento pela Oxford Nanopore Technology (ONT). O mercado do sequenciamento é praticamente dominado pelos sequenciadores da Illumina porém esta nova tecnologia está cada vez mais perto de ser tornar não apenas uma ótima alternativa como também oferecer novas análises e possibilidades para a área. Eu particularmente estou bem empolgado com o Nanopore, então vou comentar um pouco sobre esta tecnologia além das novidades apresentada na London Calling [1] que detalham o que está para vir para o Nanopore.

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Muitos provavelmente conhecem o método de sequenciamento por síntese (Sequencing By Synthesis) da Illumina que, em poucas palavras, baseia-se em ciclos de leituras de clusters de pequenas sequências conforme ocorre a polimerização. O sequenciamento por nanoporos por outro lado, baseia-se na leitura de uma molécula de DNA conforme esta atravessa o nanoporo. Mais especificamente, o sequenciador é composto por flow cells, onde há uma membrana contendo milhares de poros. Após a preparação das bibliotecas, é aplicado uma diferença de potencial entre os dois lados da membrana gerando uma corrente iônica que passa pelos poros e é medida por sensores do aparelho. Essa corrente é alterada quando uma molécula de DNA atravessa o poro, e cada nucleotídeo (A, C, T ou G) muda a corrente com uma intensidade diferente, sendo teoricamente possível identificar todas as bases de uma molécula inteira.

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Agora posso começar a contar um pouco sobre as vantagens: o aparelho MinION Mk, com um peso de 100 gramas, é do tamanho de um grampeador, o que é minúsculo comparado a um equipamento Illumina, que ocupa uma mesa inteira, ou a um PacBio Sequel, que é do tamanho de uma geladeira! Para que funcione, você simplesmente o conecta via porta USB 3.0 em um computador e tem acesso à informação do sequenciamento em tempo real. O custo do MinION também é muito menor, e embora ele ainda não tenha sido lançado comercialmente, você pode obter um ao entrar no seu programa de acesso inicial por mil dólares, o que é um valor baixo para um sequenciador. O tamanho dos reads pode chegar a uma média de 2kb dependendo do organismo, o que é um grande salto, comparado aos pequenos reads provenientes da tecnologia Illumina, em que são normalmente menores que 300bp. O Nanopore consegue também detectar alterações epigenéticas, como metilações no DNA.

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Um aspecto muito interessante que começou a ser desenvolvido recentemente é a possibilidade de um sequenciamento seletivo em tempo real [2]. Basicamente consiste em, durante o sequenciamento, verificar se o read veio de uma região genômica de interesse e caso não, parar o sequenciamento deste read e permitir que um próximo read utilize o nanoporo. Desta forma haverá uma maior quantidade de dados de interesse. Um exemplo de aplicação é o sequenciamento do microbioma humano, em que sequências provenientes de humanos não são de interesse, abrindo muitos poros para sequenciamento dos microrganismos.

A tecnologia do Nanopore ainda está em desenvolvimento, e é perceptível que ainda peca em muitos aspectos, sendo os principais a baixa quantidade de dados de saída em relação aos aparelhos da Illumina, alta taxa de erros e alto custo por base sequenciada. Entretanto, temos boas notícias para estarmos otimistas. Na London Calling 2016, um evento promovido pela ONT que ocorreu nos dias 26 e 27 de maio, a empresa apresentou diversas melhorias que estão por vir. Uma delas é a mudança do tipo de nanoporo utilizado até meses atrás.

O novo R9 poro, que é uma versão mutada da proteína CsgG da E. coli, substituirá o antigo R7 (que até aonde eu sei, não teve sua identificação revelada). Além de deixar claro que não utiliza nenhuma versão do poro patenteado pela Illumina (o que gerou um processo da gigante conta a ONT no início do ano [3]), o novo poro apresenta uma velocidade de passagem do DNA mais de 4 vezes maior, além de menor quantidade de erros, gerando então mais dados, e de melhor qualidade. Um problema ainda não resolvido é a baixa qualidade de sequenciamento de homopolímeros, porém melhoras no algoritmo de basecalling prometem aumentar a acurácia.

O desenvolvimento do PromethION, uma máquina que basicamente paraleliza várias flow cells, está bem avançado, e algumas unidades já foram enviados para teste em certos laboratórios parceiros. A quantidade de dados é na casas de terabytes por dia, conseguindo então, competir neste aspecto até com os equipamentos da Illumina.

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Além disso, A ONT está desenvolvendo alguns outros produtos muito interessantes em relação à portabilidade. Um dele é o SmidgION, que se conecta a um iPhone para um sequenciamento ainda mais portátil! O número de canais de leitura é a metade (256) de um Minion Mk 1B, porém para trabalhos menores pode ser o suficiente. O outro é o projeto Zumbador, previsto para o segundo semestre deste ano e pretende facilitar a extração de DNA e preparação das amostras.

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Como já disse, eu estou muito empolgado em relação ao Oxford Nanopore. Isto é porque a empresa não apenas lançou um sequenciador, mas também promete muitas mudanças de paradigma na área do sequenciamento, e eu espero muito, que a maioria consiga se realizar.

Referências:

[1] – https://londoncallingconf.co.uk/2016. Acessado em 05/06/2016.

[2] – Loose M, Malla S, Stout M. 2016. Real time selective sequencing using nanopore technology. bioRxiv link: http://dx.doi.org/10.1101/038760

[3] – http://www.bio-itworld.com/2016/2/24/illumina-sues-oxford-nanopore-technologies-over-composition-nanopores.html. Acessado em 05/06/2016.

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Sobre Paulo Tokimatu

Graduado em ciências biológicas pela UNICAMP e atualmente aluno de mestrado em Genética e Biologia Molecular pela mesma instituição.

2 respostas para Sequenciamento pelo Oxford Nanopore

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  2. Daniela Cristina Tartari diz:

    Olá Paulo, nosso laboratório está interessado nessa tecnologia, gostaria de saber se você conhece algum laboratório aqui do Brasil que já está usando essa tecnologia.

    Obrigada
    Daniela – Laboratório de Microbiologia Molecular Aplicada – UFSC

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