Em tempos como os atuais, temos visto muitos termos técnicos específicos na mídia e em notas de instituições que falam tanto da doença COVID-19, quanto do SARs-Cov-2 (o novo Coronavírus), quanto de sintomas e testes de diagnósticos.
Em meio a todas estas informações, embora nos habituemos a ver os termos, não necessariamente compreendemos do que se trata. Em especial sobre os diagnósticos da doença, temos visto que há mais de um tipo de teste possível de ser feito.
A Força Tarefa da UNICAMP anunciou que fará o teste chamado RT-qPCR, o qual foi considerado o principal teste de COVID-19 pela Organização Mundial da Saúde. Este texto busca explicar um pouco melhor sobre este teste e, também, o motivo pelo qual ele é importante no diagnóstico da doença.
Por que a Organização Mundial de Saúde indica o RT-qPCR como o principal diagnóstico?
O diagnóstico feito pela técnica RT-qPCR foi preconizado para se realizar o diagnóstico do COVID-19 em pacientes suspeitos por ser capaz de verificar a presença de até mesmo uma única cópia do material genético do vírus (como veremos em seguida) e, também ser uma técnica amplamente estabelecida dentro de laboratórios de biologia molecular ao redor do mundo. Isto é, por ser uma técnica que grande parte dos laboratórios do mundo inteiro já conhece o protocolo e que é usado de maneira usual em suas pesquisas.
E o que significam estas siglas? O que é, afinal, uma PCR e uma RT-PCR?
Desde quando foi criada até os dias atuais, as técnicas de PCR têm sido usadas em uma grande gama de pesquisas científicas, desde estudos sobre expressão gênica a detecção de variações genéticas dentro de uma população. Vamos compreender um pouco mais das etapas desta técnica e porque ela é importante para a detecção do novo Coronavírus?
A PCR é a sigla que significa, em português, Reação em Cadeia de Polimerase. É uma técnica de biologia molecular muito usada para analisar a presença ou ausência de um gene no DNA de um ser vivo. Polimerase é a enzima responsável, dentro das células, por catalisar a adição de novos nucleotídeos a uma cadeia de DNA ou RNA. Isto é, ela proporciona agilidade e eficácia na duplicação ou transcrição de moléculas de DNA ou RNA.
Ao usarmos a enzima polimerase em uma reação em cadeia, dentro de um ambiente controlado (tal como na técnica que estamos explicando), conseguimos “amplificar” o material genético de uma amostra coletada. Isto é, conseguimos multiplicar o número de material a partir de uma pequena quantidade de DNA ou RNA, e assim analisar a presença de trechos específicos – como a de vírus, por exemplo.
A técnica PCR acontece com a adição de várias moléculas diferentes, para desempenhar papéis definidos na identificação do material genético que queremos multiplicar. Para realizar a PCR, nós misturamos: uma enzima capaz de duplicar o DNA, resistente a altas temperaturas; bases nitrogenadas (os “tijolos” que formam o DNA); primers (pequenos moldes de RNA que grudam no começo do gene ou segmento gênico de interesse) e, por fim, o DNA do organismo que se quer analisar. Ao submetermos todos estes elementos a ciclos de altas e baixas temperaturas, somos capazes de multiplicar de forma exponencial a quantidade de cópias daquele pedaço de DNA que temos interesse.
No caso de um teste diagnóstico, ao se aplicar esta técnica, saberemos se existe o DNA do organismo (vírus) que estamos tentando detectar, após executar outra técnica chamada eletroforese em gel de agarose/poliacrilamida, que permite a visualização dos trechos de material genético que foram multiplicados. Isto é, se a pessoa está infectada, o DNA em questão será amplificado e o diagnóstico será positivo (mas ainda não é deste protocolo que se trata o diagnóstico do Coronavírus! Calma que chegaremos lá!).
O DNA e o RNA possuem pequenas diferenças, quimicamente. O SARs-CoV-2, que é o material que queremos analisar em nossas amostras, é um vírus cujo material genético é uma molécula de RNA. E isto faz diferença no protocolo que temos que estabelecer… Para isso, usamos a técnica RT-PCR, que é a Reação em Cadeia de Polimerase de Transcrição Reversa.
A grande diferença da PCR para a RT-PCR é que antes de fazermos todo o processo dito acima, nós pegamos o RNA do vírus e convertemos em um DNA complementar a ele mesmo, o chamado cDNA, (um processo que ficou famoso quando o HIV começou a ser estudado) e adicionamos esse cDNA a reação, no lugar do DNA genômico do organismo.
E, por fim, qual a diferença para o RT-PCR quantitativo (RT-qPCR)?
Geralmente as RT-PCR estão associadas a PCR quantitativa. Este processo nos permite saber quanto um gene ou o material genético de um vírus ou patógeno dentro da célula está sendo produzido.
Nesse modelo, um fluoróforo (uma molécula capaz de emitir luz) é preso a uma sonda que se liga ao gene ou pedaço de DNA de interesse. Enquanto essa molécula fluorescente estiver ligada a essa sonda, a sua luz não é emitida, mas uma vez que ela é solta, a molécula começa a emitir fluorescência.
Quando a enzima responsável por duplicar o DNA chega a esse segmento onde a sonda está ligado, ela corta-a, liberando o fluoróforo, que dessa forma começa a emitir luz(2). A partir de um sensor na máquina onde está acontecendo essa reação, somos capazes de captar a luz emitida pelo fluoróforo a cada ciclo de duplicação do DNA, e por fim, quantificar sua expressão.
No começo da reação, há poucas cópias do DNA de interesse, e dessa forma a fluorescência emitida é pouca, mas com o passar dos ciclos, onde 2 cópias se tornam 4, 8, 16, e assim por diante de forma exponencial, a quantidade de luz emitida cresce também de forma exponencial e somos capaz de contar a quantidade inicial de moléculas que tínhamos no começo.
Quais as etapas para realizar o diagnóstico da COVID-19?
A Força Tarefa da Unicamp realizará testes diagnósticos que incluem 5 etapas:
- Coleta do material dos pacientes (células da mucosa da boca e do nariz),
- Extração do RNA viral da amostra do paciente
- Conversão em DNA complementar (cDNA) ao RNA
- Duplicação exponencial do cDNA por RT-qPCR
- Análise do resultado por especialista para o diagnóstico
Todo este processo demora algumas horas, normalmente. No entanto, estamos vivendo um período atribulado, com muitos testes sendo solicitados simultaneamente. Por enquanto, a FT-Unicamp têm a previsão de disponibilizar o resultado dos testes entre 24 e 48 horas. Mas este tempo pode aumentar dependendo da demanda que tivermos durante toda a pandemia.
Direção de arte desta postagem:
Anatália Oliveira Santos – Diretora de arte do HUB Campinas
Texto feito para a Força Tarefa da Unicamp
Nossos sites institucionais:
Para saber mais:
Organização Mundial de Saúde. (2020). Coronavirus disease (COVID-19) technical guidance: Laboratory testing for 2019-nCoV in humans
Arya, M., Shergill, I. S., Williamson, M., Gommersall, L., Arya, N., & Patel, H. R.
Os argumentos expressos nos posts deste especial são dos pesquisadores, produzidos a partir de seus campos de pesquisa científica e atuação profissional e foi revisado por pares da mesma área técnica-científica da Unicamp.
Não, necessariamente, representam a visão da Unicamp. Essas opiniões não substituem conselhos médicos.
(2005). Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert review of molecular diagnostics, 5(2), 209-219.
quais são os reagentes utilizados durante o RT-qPCR e qual é a etapa limitante destas análises?
Os reagentes são: o Master Mix, que contem a maioria dos componentes químicos e biológicos que vão atuar durante a reação (como por exemplo a própria polimerase), os primers pro gene de interesse, a amostra (seja do paciente ou de qualquer outra origem biológica, animal, vegetal, bacteriana, viral) e água. Tantos os primers quanto o Master Mix vão depender da empresa da qual serão comprados, sendo de dois principais tipos: TaqMan e SYBR.
Quanto a segunda pergunta, no que diz respeito especificamente aos testes contra o SARS-CoV-2, a etapa limitante é a extração do material viral das amostras dos pacientes, pois durante essa etapa esse material ainda é infectante, representando um perigo para quem está lidando com ele. Por causa disso, a Força Tarefa da UNICAMP está trabalhando com um robô que automatiza esse processo. Caso nas outras etapas haja os insumos necessários para fazê-las, elas são relativamente mais práticas e rápidas.
Obrigado pelo post!
Parabéns!
Eu sempre tive um pouco de dúvida entre o realtime e o PCR comum. E, o por que de o realtime ser mais sensível para o diagnóstico.
desculpe isso não é pra vocês , nem pra esse site, é para elite e pra todos que não sossego pra ninguém
A maioria da população tem largar mão de agir como gado, ou seja ser levado na conversa fiada de politicos, imprensa, tv,rádio, midia, OMS, pseuda ciência, pseudos ciêntistas, filósofos, etc.
Esse povo não sabe de nada, nem da vida deles e nenhum deles não sabe nem do dia do hoje e muito menos do amnhã, isso é coisa para profetas e advinhos, isso não é ciência.
Ainda não entenderam que eles estão politizando com suas vidas, com suas psiques, seu bem estar e quando mais crédito derem a eles, mais eles vão prolongar esse caos e ganhar em cima disso.
Bilhões envolvido nisso, seja nos testes, seja nas vacinas, seja na quebradeira geral dos comercios...
O que tiver vai ser, como sempre foi, ou maioria vão agir como avestruzes o resto da vida com medo até própria sombra?
Mas, se continuarem dando ouvidos a eles, e acreditando nessas palavras, o final ninguém sabe, porque vai vir primeira onda, segunda onda, terceira onda, quarta onda, quinta onda onda...
Todos eles tem que ser presos politicos, imprensa, tv,rádio, midia, OMS, pseuda ciência, pseudos ciêntistas, pra nunca mais aprontarem uma dessa, e a chave de suas celas jogadas fora.
Esse pessoal está acabando com planeta
Tudo acontece de cima para baixo, as ordens vem de cima para baixo, se não, não haveria essa sincronia entre todos eles.
Tudo sendo feito pelas as coxas, pulando etapas e nada ciêntifico, isso é pseuda ciência.
Eles entrararam na cabeça e na vida de vocês como encostos maléficos, e se maioria não enfrentar isso vão continuar tomando conta da vida de vocês.
Guias cegos que guiam cegos o final é sempre de cair no mesmo buraco.
Depois não venham com conversa que ninguém avisou vocês, vocês a maioria são os culpados dessa pandemia do caos não acabar nunca.
Vulneráveis tem que ter o cuidado como sempre teve, agora todos enfurnados dentro de casa, não poder pegar ar puro, sol, fazer exercicios, isso é uma palhaçada de quem não entende nada de sáude, todo mundo sabe que qualquer planta desfinha e morre se não tiver sol, água, alimento e cuidados.
Desejo que todos esses causadores do caos, vão para trás das grades, e que todo dinheiro e patrimônios deles sejam distribuidos igulmente entre toda população mundial.
Desejo pra que todos eles se tornem aquilo que sempre odiaram ou seja ser parte da população e viver com menos de um salário.
NÂO EXISTE DEUSES e nem SEMI DEUSES, temos que acabar com esses previlégios e poderes.
Não entendi a parte servida como comparação entre a RT-PCR e a C-PCR. Na C-PCR apenas se multiplica os dados genéticos e a leitura é feita depois, através de comparações entre moléculas multiplicadas na C-PCR e outras moléculas de interesse comparativo, na eletroforese. Como é feita a comparação entre trechos de um DNA e outro na RT-PCR? Sinceramente não entendi.