Texto escrito por Maurílio Bonora Junior e Ana Arnt

Em tempos como os atuais, temos visto muitos termos técnicos específicos na mídia e em notas de instituições que falam tanto da doença COVID-19, quanto do SARs-Cov-2 (o novo Coronavírus), quanto de sintomas e testes de diagnósticos.

Em meio a todas estas informações, embora nos habituemos a ver os termos, não necessariamente compreendemos do que se trata. Em especial sobre os diagnósticos da doença, temos visto que há mais de um tipo de teste possível de ser feito.

A Força Tarefa da UNICAMP anunciou que fará o teste chamado RT-qPCR, o qual foi considerado o principal teste de COVID-19 pela Organização Mundial da Saúde. Este texto busca explicar um pouco melhor sobre este teste e, também, o motivo pelo qual ele é importante no diagnóstico da doença.

Arte: HUB Campinas

Por que a Organização Mundial de Saúde indica o RT-qPCR como o principal diagnóstico?

O diagnóstico feito pela técnica RT-qPCR foi preconizado para se realizar o diagnóstico do COVID-19 em pacientes suspeitos por ser capaz de verificar a presença de até mesmo uma única cópia do material genético do vírus (como veremos em seguida) e, também ser uma técnica amplamente estabelecida dentro de laboratórios de biologia molecular ao redor do mundo. Isto é, por ser uma técnica que grande parte dos laboratórios do mundo inteiro já conhece o protocolo e que é usado de maneira usual em suas pesquisas.

E o que significam estas siglas? O que é, afinal, uma PCR e uma RT-PCR? 

Desde quando foi criada até os dias atuais, as técnicas de PCR têm sido usadas em uma grande gama de pesquisas científicas, desde estudos sobre expressão gênica a detecção de variações genéticas dentro de uma população. Vamos compreender um pouco mais das etapas desta técnica e porque ela é importante para a detecção do novo Coronavírus?

A PCR é a sigla que significa, em português, Reação em Cadeia de Polimerase. É uma técnica de biologia molecular muito usada para analisar a presença ou ausência de um gene no DNA de um ser vivo. Polimerase é a enzima responsável, dentro das células, por catalisar a adição de novos nucleotídeos a uma cadeia de DNA ou RNA. Isto é, ela proporciona agilidade e eficácia na duplicação ou transcrição de moléculas de DNA ou RNA.

Arte: HUB Campinas

Ao usarmos a enzima polimerase em uma reação em cadeia, dentro de um ambiente controlado (tal como na técnica que estamos explicando), conseguimos “amplificar” o material genético de uma amostra coletada. Isto é, conseguimos multiplicar o número de material a partir de uma pequena quantidade de DNA ou RNA, e assim analisar a presença de trechos específicos – como a de vírus, por exemplo. 

A técnica PCR acontece com a adição de várias moléculas diferentes, para desempenhar papéis definidos na identificação do material genético que queremos multiplicar. Para realizar a PCR, nós misturamos: uma enzima capaz de duplicar o DNA, resistente a altas temperaturas; bases nitrogenadas (os “tijolos” que formam o DNA); primers (pequenos moldes de RNA que grudam no começo do gene ou segmento gênico de interesse) e, por fim, o DNA do organismo que se quer analisar. Ao submetermos todos estes elementos a ciclos de altas e baixas temperaturas, somos capazes de multiplicar de forma exponencial a quantidade de cópias daquele pedaço de DNA que temos interesse.

No caso de um teste diagnóstico, ao se aplicar esta técnica, saberemos se existe o DNA do organismo (vírus) que estamos tentando detectar, após executar outra técnica chamada eletroforese em gel de agarose/poliacrilamida, que permite a visualização dos trechos de material genético que foram multiplicados. Isto é, se a pessoa está infectada, o DNA em questão será amplificado e o diagnóstico será positivo (mas ainda não é deste protocolo que se trata o diagnóstico do Coronavírus! Calma que chegaremos lá!).

O DNA e o RNA possuem pequenas diferenças, quimicamente. O SARs-CoV-2, que é o material que queremos analisar em nossas amostras, é um vírus cujo material genético é uma molécula de RNA. E isto faz diferença no protocolo que temos que estabelecer… Para isso, usamos a técnica RT-PCR, que é a Reação em Cadeia de Polimerase de Transcrição Reversa.

A grande diferença da PCR para a RT-PCR é que antes de fazermos todo o processo dito acima, nós pegamos o RNA do vírus e convertemos em um DNA complementar a ele mesmo, o chamado cDNA, (um processo que ficou famoso quando o HIV começou a ser estudado) e adicionamos esse cDNA a reação, no lugar do DNA genômico do organismo.

E, por fim, qual a diferença para o RT-PCR quantitativo (RT-qPCR)?

Geralmente as RT-PCR estão associadas a PCR quantitativa. Este processo nos permite saber quanto um gene ou o material genético de um vírus ou patógeno dentro da célula está sendo produzido.

Nesse modelo, um fluoróforo (uma molécula capaz de emitir luz) é preso a uma sonda que se liga ao gene ou pedaço de DNA de interesse. Enquanto essa molécula fluorescente estiver ligada a essa sonda, a sua luz não é emitida, mas uma vez que ela é solta, a molécula começa a emitir fluorescência.

Arte: HUB Campinas

Quando a enzima responsável por duplicar o DNA chega a esse segmento onde a sonda está ligado, ela corta-a, liberando o fluoróforo, que dessa forma começa a emitir luz(2). A partir de um sensor na máquina onde está acontecendo essa reação, somos capazes de captar a luz emitida pelo fluoróforo a cada ciclo de duplicação do DNA, e por fim, quantificar sua expressão.

Arte: HUB Campinas

No começo da reação, há poucas cópias do DNA de interesse, e dessa forma a fluorescência emitida é pouca, mas com o passar dos ciclos, onde 2 cópias se tornam 4, 8, 16, e assim por diante de forma exponencial, a quantidade de luz emitida cresce também de forma exponencial e somos capaz de contar a quantidade inicial de moléculas que tínhamos no começo. 

Quais as etapas para realizar o diagnóstico da COVID-19?

Arte: HUB Campinas

A Força Tarefa da Unicamp realizará testes diagnósticos que incluem 5 etapas:

  1. Coleta do material dos pacientes (células da mucosa da boca e do nariz), 
  2. Extração do RNA viral da amostra do paciente
  3. Conversão em DNA complementar (cDNA) ao RNA
  4. Duplicação exponencial do cDNA por RT-qPCR
  5. Análise do resultado por especialista para o diagnóstico

Todo este processo demora algumas horas, normalmente. No entanto, estamos vivendo um período atribulado, com muitos testes sendo solicitados simultaneamente. Por enquanto, a FT-Unicamp têm a previsão de disponibilizar o resultado dos testes entre 24 e 48 horas. Mas este tempo pode aumentar dependendo da demanda que tivermos durante toda a pandemia.

Direção de arte desta postagem:
Anatália Oliveira Santos – Diretora de arte do HUB Campinas

Texto feito para a Força Tarefa da Unicamp

Nossos sites institucionais:

Força Tarefa da Unicamp

Unicamp – Coronavírus

Para saber mais:

Organização Mundial de Saúde. (2020). Coronavirus disease (COVID-19) technical guidance: Laboratory testing for 2019-nCoV in humans

Arya, M., Shergill, I. S., Williamson, M., Gommersall, L., Arya, N., & Patel, H. R.


editorial

(2005). Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert review of molecular diagnostics, 5(2), 209-219.

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Os argumentos expressos nos posts deste especial são dos pesquisadores, produzidos a partir de seus campos de pesquisa científica e atuação profissional e foi revisado por pares da mesma área técnica-científica da Unicamp. Não, necessariamente, representam a visão da Unicamp. Essas opiniões não substituem conselhos médicos.


editorial


4 comentários

Cristina Aparecida Andrade Raymundo Gaiotto · 3 de maio de 2020 às 16:22

quais são os reagentes utilizados durante o RT-qPCR e qual é a etapa limitante destas análises?

    Maurílio Bonora Júnior · 3 de maio de 2020 às 17:26

    Os reagentes são: o Master Mix, que contem a maioria dos componentes químicos e biológicos que vão atuar durante a reação (como por exemplo a própria polimerase), os primers pro gene de interesse, a amostra (seja do paciente ou de qualquer outra origem biológica, animal, vegetal, bacteriana, viral) e água. Tantos os primers quanto o Master Mix vão depender da empresa da qual serão comprados, sendo de dois principais tipos: TaqMan e SYBR.

    Quanto a segunda pergunta, no que diz respeito especificamente aos testes contra o SARS-CoV-2, a etapa limitante é a extração do material viral das amostras dos pacientes, pois durante essa etapa esse material ainda é infectante, representando um perigo para quem está lidando com ele. Por causa disso, a Força Tarefa da UNICAMP está trabalhando com um robô que automatiza esse processo. Caso nas outras etapas haja os insumos necessários para fazê-las, elas são relativamente mais práticas e rápidas.

Sao Carlos · 9 de maio de 2020 às 18:40

Obrigado pelo post!
Parabéns!
Eu sempre tive um pouco de dúvida entre o realtime e o PCR comum. E, o por que de o realtime ser mais sensível para o diagnóstico.

Como se detecta o coronavírus? | Coronavírus (COVID-19) | Especial Blogs de Ciências da Unicamp · 26 de abril de 2020 às 22:57

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