Entenda a Engenharia Metabólica

ResearchBlogging.orgUma das grandes maravilhas da humanidade – objeto de grande satisfa√ß√£o entre os qu√≠micos – √© uma tabela que nos diz tudo o que existe no universo, os cerca de 120 elementos que formam tudo aquilo que o ser humano conseguiu perceber. Usando essa mesma ideia, cientistas conseguiram determinar 12 subst√Ęncias principais que podem produzir tudo… o que existe dentro de uma c√©lula! Esse √© um dos princ√≠pios fundamentais da Engenharia Metab√≥lica, entenda o porqu√™:

Os 12 Precursores Principais

Tudo o que uma c√©lula consome sempre produz compostos que chamamos de “precursores principais”. S√£o esses precursores que podem gerar tudo dentro da c√©lula: desde seu DNA at√© √†s membranas celulares. Na bact√©ria E.coli, por exemplo, existem 12 dessas subst√Ęncias principais: Eritrose 4-fosfato, o famoso Acetil CoA,¬† Frutose 6-fosfato, Glucose 6-fosfato, Alfa-cetoglutarato, Oxaloacetato, Ribose 5-fosfato, Fosfoenolpiruvato, 3-fosfoglicerato, Piruvato (esse carinha √© famoso tamb√©m), Triose-fosfato e Succinil CoA. Isso quer dizer que a grande maioria de todas a milhares de rea√ß√Ķes dentro da E.coli em algum momento formam e/ou consomem essas subst√Ęncias em suas etapas de rea√ß√£o.

Assim, ao melhor estilo dos antigos alquimistas, pesquisadores – em especial FC Neidhardt – dissecaram c√©lulas de E.coli de modo a determinar a quantidade desses precursores que seria necess√°ria para “construir” uma bact√©ria (ver infogr√°fico acima):

Ou seja, todos os precusores somados √†s mol√©culas para se realizar oxida√ß√Ķes (NAD), redu√ß√Ķes (NADPH) e fornecer energia (ATP), resultam em 1 mol de “XR”, que √© a quantidade de biomassa produzida com esses compostos, ou “1 mol de c√©lulas” (definida aqui como a quantidade de c√©lulas em 10^6g). XR seria um arcabou√ßo que abarca todas as prote√≠nas,¬† lip√≠deos e¬† nucleot√≠deos da c√©lula; por isso n√£o podemos dizer que essa √© de fato uma equa√ß√£o qu√≠mica, mas uma “pseudo-equa√ß√£o qu√≠mica”, afinal d√° pra ver claramente que as quantidades das subst√Ęncias n√£o se conservam em termos estequiom√©tricos – pra falar a verdade, n√£o h√° nem a representa√ß√£o de elementos, s√£o s√≥ siglas.

Enfim, esse √© o mais pr√≥ximo que chegamos do desejo dos alquimistas de obter uma receita para a vida como eles idealizaram, mas apesar de parecer pouco, essa pseudo-rea√ß√£o global de “constru√ß√£o de c√©lulas” nos permite contabilizar literalmente quais s√£o os recursos que as bact√©rias t√™m para produzir coisas que n√£o produzem natualmente, ou seja, nos mostram quais s√£o as cartas em jogo quando se altera um organismo geneticamente. E o nome desse jogo √© fluxo, fluxo metab√≥lico.

O Fluxoma

Uma c√©lula √© como se fosse uma mini ind√ļstria: seus oper√°rios s√£o enzimas, a chefia √© a informa√ß√£o gen√©tica e a mat√©ria prima s√£o os metab√≥litos externos com o qual se produzem as pe√ßas – que s√£o os 12 metab√≥litos principais – para a linha de montagem: as etapas de rea√ß√Ķes bioqu√≠micas. Essa pequena empresa √© um empreendimento talhado pelo mercado competitivo, ditado pela economia minimizadora de enegia, seguindo a l√≥gica da sele√ß√£o natural. Igualzinho √†s empresas de verdade. Mas enfim, a grande pergunta √©: o que acontece quando a chefia muda? O que acontece quando modificamos geneticamente um microrganismo? Apenas colocar uma informa√ß√£o gen√©tica n√£o natural na “chefia” √© o mesmo que colocar um administrador inexperiente no comando de todo um processo produtivo que ele n√£o conhece. √Č ir contra milhares de anos de sele√ß√£o natural.

Arte de Pedro Pantai. Visite http://meninodacaixadesapato.blogspot.com.br/

Por exemplo, imagine que a nossa c√©lula √© uma f√°brica de motos. Depois de muitos anos existindo, decidem colocar uma nova chefia adjunta no comando. O novo chefe adjunto decide colocar uma nova maquinaria e funcion√°rios no ch√£o de f√°brica, pois quer ampliar a gama de produtos que a empresa fabrica. A ind√ļstria de motos ent√£o passa a produzir triciclos; nada mal. O problema √© que a nova chefia S√ď faz isso. Ele n√£o comunica os antigos funcion√°rios sobre a nova produ√ß√£o, n√£o compra mais mat√©ria prima e, apesar de desejar que o carro chefe da empresa seja triciclos, n√£o move uma palha para que isso aconte√ßa. Em outras palavras: temos uma f√°brica de motos que improvisa na fabrica√ß√£o de triciclos. √Č a√≠ que entra o engenheiro de produ√ß… Ops, o “engenheiro metab√≥lico”.

O grande problema da nossa ind√ļstria de motos √© apenas de distribui√ß√£o das pe√ßas, afinal – simplificadamente – a grande diferen√ßa do produto antigo para o novo √© apenas uma roda. Da mesma maneira, em uma c√©lula a grande diferen√ßa entre os componentes que ela j√° produz para existir (o “XR” da pseudo-rea√ß√£o acima) e as novas subst√Ęncias que queremos que ela produza (por modifica√ß√Ķes gen√©ticas) √© apenas uma combina√ß√£o de quantidades diferentes dos 12 precursores principais que levem √†s rea√ß√Ķes de s√≠ntese que queremos. Para ter controle dessas rea√ß√Ķes que levam √† XR e/ou ao bioproduto desejado, cria-se o chamado “fluxoma”, a contabiliza√ß√£o de todos as taxas de rea√ß√£o (os fluxos) de dentro da c√©lula – da mesma forma que o genoma √© a contabiliza√ß√£o de toda a informa√ß√£o gen√©tica de uma c√©lula.

ATEN√á√ÉO: se a matem√°tica n√£o √© sua amiga, tome cuidado com o conte√ļdo a seguir.

Fluxos Metabólicos

A teoria que se aplica para a determina√ß√£o desses fluxos baseia-se na simples conserva√ß√£o de masa em um sistema fechado, no caso uma c√©lula ou um compartimento celular fechado com metab√≥litos; especificando a reversibilidade das rea√ß√Ķes e quais metab√≥litos s√£o considerados como internos e externos. A equa√ß√£o geral que descreve a conserva√ß√£o de massa de metab√≥litos em um sisema de volume definido pode ser escrita como:

Em que C (mol/L) √© um vetor da concentra√ß√£o de m metab√≥litos internos; r ((mol/L)/h) √© o vetor do grau de rea√ß√£o, ou seja o fluxo,¬† de n rea√ß√Ķes que convertem metab√≥litos; S √© a matriz estequiom√©trica de dimens√Ķes¬† m x n cujos elementos sij representam o coeficiente estequiom√©trico do elemento i envolvido na rea√ß√£o j; e őľ (1/h) √© o grau espec√≠fico de dilui√ß√£o associado com a mudan√ßa no volume de um sistema, o que √© muito importante considerar no modelo, pois o graus de dilui√ß√£o afetam diretamente as velocidades de rea√ß√£o. Como em uma c√©lula o grau de dilui√ß√£o √© muito baixo quando comparado com os graus de rea√ß√£o, as mudan√ßas de volume no sistema s√£o consideradas negligenci√°veis. Temos portanto a equa√ß√£o mais simplificada:

Em um estado estacion√°rio, que √© o que se considera na an√°lise de um fluxo metab√≥lico, n√£o h√° ac√ļmulo de metab√≥litos, e portanto suas concentra√ß√Ķes, bem como a popula√ß√£o bacteriana, tornam-se constantes, fazendo com que dC/dt¬†= 0:

A caracteriza√ß√£o de rea√ß√Ķes revers√≠veis √© realizada atrav√©s da detremina√ß√£o do sinal de ri, em que ri <¬†0 delimita a rea√ß√£o ocorrendo no sentido oposto, ri = 0 informa a sua n√£o-ocorr√™ncia e ri >¬†0 indica uma rea√ß√£o ocorrendo no sentido esperado.

Uma outra maneira mais simplista de se entender o mesmo raciocínio, partindo do mesmo princípio de conservação de massa, pode ser:

O que √© o mesmo que S.r = 0. Considerando as subst√Ęncias envolvidas em v√°rias rea√ß√Ķes, teremos o mesmo resultado:

OBSERVA√á√ÉO: Aqui acaba o conte√ļdo matem√°tico. Pode continuar a ler abaixo, j√° passou…!

Análise de Vias Metabólicas

Ent√£o, como d√° pra perceber, tudo se resume a encontrar um sistema de equa√ß√Ķes – sim, os sisteminhas de equa√ß√Ķes que voc√™ aprende a resolver na escola – que descreva o metabolismo da c√©lula envolvendo os metab√≥litos principais. √Ȭ†exatamente¬†aqui que entram os dados da pseudo-rea√ß√£o global comentada no in√≠cio, √© ela que define, junto com dados experimentais de consumo de substratos, o conjunto de solu√ß√Ķes desse sistema de equa√ß√Ķes (chamados de “modos elementares”). Os sistemas de equa√ß√Ķes obtidos por an√°lise das vias metab√≥licas s√£o sempre indeterminados, uma vez que o n√ļmero de rea√ß√Ķes bioqu√≠micas as envolvendo √© muito maior que o n√ļmero de esp√©cies de metab√≥litos, ou seja: tem-se mais equa√ß√Ķes que vari√°veis. A tarefa de programas de an√°lise de vias metab√≥licas √© encontrar poss√≠veis solu√ß√Ķes para esse sistema que digam quais s√£o os poss√≠veis fluxos de todas as rea√ß√Ķes envolvidas, com isso √© poss√≠vel analisar qual modo elementar √© o que possui maior rendimento de produ√ß√£o do bioproduto desejado, e portanto quais rea√ß√Ķes que devem ocorrer no sistema em detrimento de outras.

Por exemplo, vejamos o exemplo da produ√ß√£o de Lisina em Corynebacterium glutamicum. Esse amino√°cido √© naturalmente produzido em n√≠vel basal na c√©lula para manuten√ß√£o da atividade celular, apenas super-expressando os genes envolvidos nas vias de produ√ß√£o de lisina e nocauteando outros genes que produzem enzimas competidoras (essas s√£o grandes maneiras de se alterar os fluxos metab√≥licos) da bios√≠ntese de lisina √© poss√≠vel aumentar cerca de 11 vezes a produtividade. Isso pode ser feito sem an√°lise nenhuma. Mas se analisando os fluxos metab√≥licos (imagem abaixo), vemos que √© poss√≠vel quase dobrar a produ√ß√£o industrial de Lisina √† partir da mesma quantidade de glicose. Assim como na analogia entre a ind√ļstria e a c√©lula, √ļnica diferen√ßa foi a distribui√ß√£o dos fluxos entre os precursores principais da C. Glutamicum, ou seja uma combina√ß√£o diferente de quantidades dos precursores em diferentes rea√ß√Ķes.

No caso, um aumento do fluxo metab√≥lico pela via das pentoses (formando Ribulose 5-fosfato) em um processo sem produ√ß√£o de CO2 – realizando o ciclo do glioxilato¬†– aumenta a produ√ß√£o por gerar mais NADPH, necess√°rio na bios√≠ntese de Lisina, e que n√£o √© produzida na via “normal” de degrada√ß√£o da glicose (via de Embden-Meyerhoff-Parnas).

O Futuro da Engenharia Metabólica

Muitos dizem que a engenharia metab√≥lica ser√° t√£o eficiente em otimizar os processos biotecnol√≥gicos que substituir√° completamente os processos qu√≠micos org√Ęnicos¬†no futuro, afinal esse √© o grande entrave para termos toda uma ind√ļstria baseada em uma bioprodu√ß√£o: os processos qu√≠micos s√£o muito mais eficientes. Ter toda a ind√ļstria qu√≠mica baseada na produ√ß√£o de materiais por organismos nos daria um mundo mais ecol√≥gico e renov√°vel. O grande passo para isso j√° foi dado com a “synthia“, a bact√©ria sint√©tica de Craig Venter e seu grupo. O desafio de se fazer engenharia metab√≥lica √© justamente o problema que foi eliminado – EDITED: OK, n√£o eliminado, mas amenizado – quando se nocauteou todos os genes n√£o essenciais para a sobreviv√™ncia na bact√©ria produzida por Venter, pois qualquer nova via colocada no microrganismo j√° estaria quase completamente otimizada, uma vez que n√£o existiriam fluxos “n√£o essenciais” em que a bact√©ria poderia estar “desperdi√ßando” energia em vez produzir o bioproduto dos genes com que foi modificada. Assim, como um upgrade da engenharia gen√©tica, a engenharia metab√≥lica faz aquilo que torna a Biologia Sint√©tica algo simples e bonito: apenas uma mudan√ßa inteligente de como a informa√ß√£o √© transmitida; uma mudan√ßa de design. No final das contas, mais do que pseudo-realizar os sonhos dos alquimistas, entender os fluxos metab√≥licos √© mudar a maneira como os qu√≠micos atuais sonham com o futuro, afinal, porque reinventar como produzir subst√Ęncias org√Ęnicas se os pr√≥prios organismos podem fazer isso pela gente!? J√° est√° mais do que na hora de reinventarmos nossa ind√ļstria.

Referências

Vallino JJ, & Stephanopoulos G (2000). Metabolic flux distributions in Corynebacterium glutamicum during growth and lysine overproduction. Reprinted from Biotechnology and Bioengineering, Vol. 41, Pp 633-646 (1993). Biotechnology and bioengineering, 67 (6), 872-85 PMID: 10699864

Neidhardt, F. C., J. Ingraham, and M. Schaechter. 1990. Physiology of the Bacterial Cell: A Molecular Approach. Sinauer Associates, Sunderland, MA.