FAQ #4 Onde colocar esses pedaços de DNA?

FAQ da Bioengenharia 4

‚ÄúNo genoma, n√©, d√™r!‚ÄĚ. Certo, mas como? E ser√° que o genoma √© o √ļnico lugar que podemos colocar esse novo pedacinho de DNA no micro-organismo que queremos modificar? N√£o! Existe outro lugar tamb√©m e ele se chama plasm√≠deo (quem j√° jogou BioShock vai soltar umas sinapses a mais agora).

30_bioshock_lg

 

O plasm√≠deo √© um DNA circular presente em v√°rias esp√©cies de seres vivos e √© respons√°vel por conter informa√ß√Ķes valiosas envolvendo a sobreviv√™ncia do organismo a fatores externos (como por exemplo sua resist√™ncia a um antibi√≥tico), al√©m de ser o principal ator da transfer√™ncia horizontal de informa√ß√£o gen√©tica, ou seja, a passagem de um DNA funcional de um ser vivo para outro sem haver hereditariedade (√© a√≠ que o jogo BioShock extrapola isso para seres humanos).¬†Adivinha de onde veio a ideia de usar o plasm√≠deo como transmissor – “vetor” – de informa√ß√£o gen√©tica para modificar as c√©lulas? Veio exatamente desse mecanismo natural de realizar transfer√™ncia horizontal de genes que v√°rios micro-organismos possuem, ent√£o aproveitamos para fazer a transfer√™ncia das informa√ß√Ķes gen√©ticas que n√≥s queremos!

E se vamos usar plasm√≠deos √© preciso extra√≠-los tamb√©m!¬†Os plasm√≠deos s√£o mol√©culas de DNA assim como os pedacinhos obtidos a partir de um genoma, e multiplicados pela PCR, que vamos introduzir no microorganismo, mas aqui h√° uma etapa importante durante a¬†extra√ß√£o de DNA¬†onde √© feita a separa√ß√£o do conte√ļdo plasmidial do gen√īmico.

O vídeozinho abaixo tem uma animação no ínicio e depois mostra o procedimento do isolamento do plasmídeo em lab!

[youtube_sc url=”http://www.youtube.com/watch?v=8xEDEJ0DHFA”]

Por Otto Heringer e Viviane Siratuti.

Aventuras em Biologia Sintética

Drew Endy

Eu considero os quadrinhos como uma das formas mais interessantes de se narrar uma história. São também uma ótima forma de divulgar ciência de uma maneira didática e divertida.

Drew Endy um dos pais da biologia sintética (e do Registry of Parts), juntamente com Isadora Deese (ambos do MIT) elaboraram o quadrinho Adventures in Synthetic Biology. E tem mais: o quadrinho foi publicado no website da prestigiada revista Nature.

Confira Adventures in Synthetic Biology e aprenda de maneira didática o que são biobrick, PoPs, entre outros conceitos básicos.

 

Links possivelmente interessantes:

 

Microalgas na Biologia Sintética

ResearchBlogging.orgNa pen√ļltima reuni√£o do Clube de Biologia Sint√©tica foi discutido em que p√© andam as pesquisas envolvendo microalgas – uma das milagrosas fontes energia sustent√°vel e fixa√ß√£o de CO2 – no contexto da Biologia Sint√©tica.¬†O apresentador da vez, Jo√£o Molino,¬†com base nos conhecimentos que vem adquirindo no seu doutorado na Farm√°cia (FCF) aqui na USP, nos deu¬†um review dos trabalhos com microalgas usadas em Biologia Sint√©tica, al√©m de falar um pouco de como as microalgas s√£o incr√≠veis para converter energia solar em bioprodutos e – consequentemente – fixar CO2. Com isso ele sugere no final algumas oportunidades que poder√≠amos usar para projetos do iGEM do ano que vem.

V√≠deo com “Pipotecnica”

Como tivemos problemas envolvendo a transmiss√£o da reuni√£o (que j√° era feita de maneira prec√°ria), resolvemos gravar novamente a apresenta√ß√£o, s√≥ que desta vez utilizando uma nova pirotecnia dos v√≠deos da internet, o Popcornmaker (veja mais sobre ele nessa palestra de 4min no TED). Junto ao v√≠deo ir√£o aparecer muitos links e informa√ß√Ķes extras diretamente da wikip√©dia em ingl√™s (nunca substimem a wikip√©dia em ingl√™s!), portanto se quiser saber mais sobre alguma informa√ß√£o “ao vivo” durante o v√≠deo, cheque os links!¬†[clique na imagem abaixo para ir ao v√≠deo em outra aba]

Anota√ß√Ķes Pessoais

Apesar do custo/benef√≠cio das pesquisas de microalgas na ind√ļstria n√£o ser muito bom – segundo o que o Mateus¬†me contou outro dia – suas caracter√≠sticas s√£o muito provocativas para serem usadas como solu√ß√£o ecol√≥gica para muitos problemas e melhorar bastante processos de produ√ß√£o de bioprodutos j√° existentes. Ela faz coisas simplesmente incr√≠veis. Como o Jo√£o mostra no v√≠deo, ela √© campe√£ na produ√ß√£o de gal√Ķes/acre de √≥leo, al√©m de poder viver em ambientes completamente isolados, como em uma garrafa fechada por exemplo – diga a√≠, qual ser vivo que voc√™ encontra no seu dia a dia (sem contar microalgas n√©…) que consegue viver muito bem e por muito tempo num ambiente completamente fechado e sem ar! Ela tamb√©m fixa CO2 que √© uma beleza, produz hidrog√™nio (hidrog√™nio cara!) e ainda pode ser usada como biorremediador (e de fato √© naturalmente) para limpar √°reas contaminadas!

Al√©m de ser muito interessante biotecnologicamente, as microalgas s√£o um grande gargalo na biologia sint√©tica devido √† falta de BioBricks e de elementos de DNA padronizados, como suas sequ√™ncias terminadoras. O que √© bem legal para o Registry of Parts e para o iGEM: partes in√©ditas! O time do chile do iGEM deste ano foi um dos primeiros a conseguir transformar cianobact√©rias (“parentes” das microalgas) com sucesso utilizando BioBricks na competi√ß√£o, o que √© um bom ind√≠cio para se trabalhar com microalgas.

O Grande Desafio

Apesar disso tudo, trabalhar com microalgas é algo bem desafiador, muito por causa do item mais valioso que se tem em laboratório: tempo. Um processo inserção de vetor nas células que duraria apenas (no máximo!) 2 dias de trabalhando com E.coli, com nossas amigas verdinhas duraria cerca de uma a duas semanas (se não me engano, segundo o que o João me contou). Para se fazer um projeto desse tipo estaríamos um pouco limitados para o pouco tempo do iGEM, a não ser que nos organizássemos muito bem (ainda estamos trabalhando nesse quesito). Mas o interessante é que aparentemente elas são bem geneticamente estáveis quando se tratando do vetor inserido; pelo o que o João nos contou, algumas microalgas transformadas duram anos com o seu novo pedaço de DNA. O processo de transformação também é aparentemente tranquilo e sem muito mistério.

Seguindo com os nossos objetivos de criar um projeto para o iGEM, muitas ideias surgiram da potencialidade de trabalhar com microalgas. Particularmente, comecei a pensar num sistema em que as microalgas “alimentassem” uns extrem√≥filos, para que eles produzissem um efeito desejado com suas habilidades √ļnicas da natureza – habilidades extremas! Mas discorro sobre isso em futuros posts.

Referência Principal

Durante o vídeo, muitas referências interessantes apareceram com ajuda  do Popcornmaker, mas a referência principal que guiou o overview que o João nos fez é essa aí embaixo:

  • Wang B, Wang J, Zhang W, & Meldrum DR (2012). Application of synthetic biology in cyanobacteria and algae. Frontiers in microbiology, 3 PMID: 23049529

Polimerase Por Segundo

ResearchBlogging.orgA Biologia √© imprecisa por natureza, e vice versa. Isso √© uma grande dificuldade ao se fazer design de sistemas biol√≥gicos sint√©ticos; aquilo que √© muito bonito no papel √†s vezes nunca pode ser feito por motivos obscuros e por excesso de ru√≠do dos sinais do sistema. N√£o d√° pra prever. Na tentativa de deixar dispositivos sint√©ticos mais previs√≠veis, a Biologia Sint√©tica tenta padronizar n√£o somente partes biol√≥gicas, mas tamb√©m os sinais que a comp√Ķem a din√Ęmica de seu sistema. Esses sinais s√£o justamente a passagem de informa√ß√£o entre DNA e o fen√≥tipo desejado, mas… como diabos deixar isso mais preciso e medir a velocidade dessa passagem de informa√ß√£o? Como medir “Polimerases Por Segundo”?

Padronização da Transmissão de Informação

Independente do que um aparelho el√©trico fa√ßa, existem sinais “universais” que pertencem a todos eles: varia√ß√Ķes na diferen√ßa de potencial, na corrente, no campo el√©trico e etc. A transmiss√£o de informa√ß√£o entre os dispositivos eletr√īnicos que comp√Ķem esse aparelho s√£o dadas justamente atrav√©s desses sinais, fazendo todo o sistema el√©trico funcionar. Em circuitos gen√©ticos, sinais an√°logos √† corrente el√©trica s√£o as taxas de transcri√ß√£o e tradu√ß√£o, ou mais especificamente, a velocidade com que – respectivamente – uma polimerase e um ribossomo “le√™m” seus nucleot√≠deos. O problema √© que esses sinais (as taxas de transcri√ß√£o e tradu√ß√£o) n√£o s√£o bons como transmissores de sinais. Entenda o porqu√™:

PoPS e RiPS: Qual é o sentido disso!?

Para que um transmissor de sinal seja bom, ele precisa facilitar com que dispositivos possam ser facilmente combinados em um sistema – al√©m de ser algo “universal”, como foi dito anteriormente. Foi a√≠ ent√£o que, usando experi√™ncias da engenharia, os bi√≥logos sint√©ticos cunharam o termo “PoPS” (Polimerase Per Second – Polimerase Por Segundo) e “RiPS” (Ribossome Per Second – Ribossomo Por Segundo). Muitos pesquisadores acham que a cria√ß√£o desses novos termos √© como “reinventar a roda”: qual seria a grande diferen√ßa entre isso e as cl√°ssicas taxas de transcri√ß√£o e tradu√ß√£o? A diferen√ßa √© a abrang√™ncia da nova medida. Quando se trata de um s√≠tio operador, um RBS, um RNAm e o pr√≥prio gene sendo “lido”, n√£o h√° diferen√ßa alguma em se medir uma taxa de transcri√ß√£o e o “PoPS” ou uma taxa de tradu√ß√£o e o “RiPS”. Mas faz sentido se medir a taxa de transcri√ß√£o de um s√≠tio terminador por exemplo!? Esse elemento de DNA, que teoricamente n√£o √© transcrito (√© ele quem justamente para a transcri√ß√£o), ainda pode eventualmente ter um “leak” e permitir a passagem de uma polimerase. Usar a express√£o “… a taxa de transcri√ß√£o de um s√≠tio terminador …” n√£o faz sentido nenhum, mas acontece. Se usarmos PoPS, que por defini√ß√£o √© o n√ļmero de vezes que uma RNA polimerase passa por um ponto espec√≠fico de uma mol√©cula de DNA por unidade de tempo, ainda h√° sentido, pois nessa defini√ß√£o n√£o importa qual a regi√£o do DNA a Polimerase passa. √Č esse tipo de generalidade que permite o f√°cil uso e novas combina√ß√Ķes de dispositivos sint√©ticos.

Hierarquia de Abstração

Com a cria√ß√£o de sistemas f√°ceis de se integrar, os engenheiros biol√≥gicos podem se beneficiar de m√©todos largamente praticados em qualquer campo da engenharia, como a hierarquia de abstra√ß√£o. Com isso √© mais simples se lidar com a complexidade de sistemas biol√≥gicos quando se omite informa√ß√Ķes desnecess√°rias. Desse modo (ver imagem abaixo), algu√©m trabalhando no n√≠vel de abstra√ß√£o das partes biol√≥gicas n√£o precisa se preocupar com o design e s√≠ntese do DNA que usar√°, do mesmo modo, algu√©m trabalhando no n√≠vel sist√™mico precisa pensar em apenas quais dispositivos incluir e como conect√°-los para realizar uma fun√ß√£o desejada, sem precisar se preocupar com os outros n√≠veis de abstra√ß√£o.

Imagem retirada de: D. Baker, G. Church, J. Collins, D. Endy, J. Jacobson, J. Keasling, P. Modrich, C. Smolke, and R. Weiss. ENGINEERING LIFE: Building a FAB for biology. Scientific American, pages 44‚Äď51, June 2006.

Como medir PoPS?

A maioria dos sistemas criados e estudados hoje em dia em Biologia Sint√©tica envolve controle transcricional da atividade gen√©tica, o que faz do PoPS a vari√°vel mais difundida na √°rea, principalmente pelas pesquisas envolvendo l√≥gica booleana em sistemas gen√©ticos¬†(portanto n√£o √© muito comum encontrar “RiPS” em artigos por a√≠).
N√£o existe um m√©todo direto para se medir PoPS, mas √© poss√≠vel chegar em seu valor indiretamente atrav√©s de medi√ß√Ķes de fluoresc√™ncia de genes reporter. √Č poss√≠vel – se voc√™ puder encontrar os par√Ęmetros na literatura ou med√≠-los – encontrar o PoPS de um dispositivo em cinco passos:

Cinco Passos Para o PoPS

1. Ligação de um Gene Repórter como Output

Antes de mais nada, ser√° preciso de um fluor√≠metro (√© claro) e demum espectofot√īmetro para medir densidade celular. Como exemplo, vamos observar a parte BBa_F2620:

Esse BioBrick tem como “entrada” a subst√Ęncia de quorum sensing 3-oxohexanoil-homoserina lactona e tem como “sa√≠da” PoPS. Em presen√ßa de 3OC6HSL, o gene que produz o fator de transcri√ß√£o luxR promove a transcri√ß√£o de genes ap√≥s o Lux pR, na parte final do BioBrick BBa_F2620. Para mensurar o qu√£o ativo o luxpR fica, liga-se outro BioBrick no final do dispositivo para mudar o output do sistema colocando-se o BBa_E0240¬†–¬†a ORF (Open Reading Frame) do GFP (Green Fluorescent Protein):

Assim tem-se uma nova parte, o BioBrick BBa_T9002:

2. Medi√ß√£o da Fluoresc√™ncia e Absorb√Ęncia e Subtra√ß√£o do Background

Para medir a fluoresc√™ncia do GFP e a absorb√Ęncia da amostra de c√©lulas, √© preciso criar dois controles: um da absorb√Ęncia (A) e outro da fluoresc√™ncia (G). O controle da fluoresc√™ncia ser√° o pr√≥prio BBa_T9002 sem ser induzido pela subst√Ęncia de quorum sensing (G_n√£o-induzido), enquanto o controle da absorb√Ęncia √© feita da maneira trivial, verificando somente a absorb√Ęncia do meio de cultura (A_background). Para se obter os reais valores de Fluoresc√™ncia induzida por 3OC6HSL e da densidade celular, basta ent√£o subtrair esses valores de background com os valores medidos durante a indu√ß√£o pela subst√Ęncia de quorum sensing:

3. Correlação com a Curva Padrão

Com as corre√ß√Ķes em m√£os, outro procedimento trivial a ser feito √© encontrar a curva padr√£o de fluoresc√™ncia versus GFP e de absorb√Ęncia versus n√ļmero de c√©lulas. Por exemplo, experimentos feitos em laborat√≥rio chegaram a essas retas de correla√ß√£o de valores:

Em que UFC √© “Unidade Formadora de Col√īnia” – o n√ļmero de c√©lulas na amostra. E “GFP” seria o n√ļmero de mol√©culas de GFP medidas.

4. Interpolar a Curva de GFP versus Tempo Obtida na Medição

A s√≠ntese total de GFP por c√©lula (S_c√©lula) √© dada pela taxa de produ√ß√£o de GFP total (S_total) dividida pelo n√ļmero de c√©lulas (UFC):

Para encontrar a derivada de [GFP] por tempo, basta plotar os dados de GFP obtidos por tempo e interpolar com uma função logística (provavelmente) para obter a equação que melhor descreve a variação de GFP no tempo.

5. Colocar os Valores Nessa Equação Aqui

Depois de determinada a função Scélula, basta colocá-la nessa fórmula e encontrar o PoPS:

Em que:
a = Taxa de maturação do GFP Р1/s
GammaM = Constante de degradação do RNA Р1/s
GammaI = Constante de degradação do GFP imaturo Р1/s
R√ī = Constante de s√≠ntese proteica por RNAm (RiPS) – [Prote√≠na]/[RNAm].s
PoPS = Polimerase por segundo – [mRNA]/[DNA].s

CUIDADO: Conte√ļdo Matem√°tico – Prossiga com Cuidado (Ou n√£o…)

Chega-se nessa express√£o atrav√©s de um pequeno sistema de equa√ß√Ķes diferenciais:

As equa√ß√Ķes expressam uma din√Ęmica simplificada de um sistema de transcri√ß√£o e tradu√ß√£o de uma informa√ß√£o gen√©tica. Para chegar na express√£o de PoPS, basta substituir a √ļltima equa√ß√£o na segunda e isolar M. Com a express√£o resultante, basta substituir a vari√°vel M na primeira equa√ß√£o e sua derivada em dM/dt.

ATEN√á√ÉO: Aqui acaba o conte√ļdo matem√°tico. Est√° tudo bem agora.

E essa √© a hist√≥ria de como voc√™ pode encontrar o PoPS – essa vari√°vel estranha! – no seu pr√≥prio laborat√≥rio (ou ao menos entender do que se trata). Assim como um circuito el√©trico, que pode ser montado da melhor maneira poss√≠vel e mesmo assim n√£o funcionar por raz√Ķes obscuras, sistemas biol√≥gicos t√™m muito mais esse problem√°tico costume de n√£o se comportar como esperado. Contudo essa abordagem mais generalista da atividade transcricional de uma c√©lula √© uma boa maneira de se tentar enfrentar o grande desafio de se deixar a biologia mais “engenheir√°vel” e mais “precisa”. N√£o que essa seja a coisa mais f√°cil do mundo, mas ela nunca ser√° se ningu√©m tentar. E estamos aos poucos conseguindo.

Referências:

Synbio na terra da Mafalda

Autor: Ivan Lavander, estudante de Ciências Biológicas РUSP

Entre os dias 16 e 22 de abril rolou um curso introdutório de biologia sintética, o primeiro desse tipo na America Latina, hosteado pela Universidade de Buenos Aires e financiado pela Organização Europeia de Biologia Molecular (EMBO). Eu fui um dos participantes selecionados, e vou divulgar numa série de posts um pouco do que rolou por lá =)
Esse √© um primeiro post sumarizando o curso, e os pr√≥ximos posts com a sigla¬†[SBAr]¬†se referem ao conte√ļdo do curso!

Estrutura do Curso¬†– O curso se focou em introduzir os participantes nos principais m√©todos, estrat√©gias e desafios do synbio. Mesmo nessa fase inicial, algumas id√©ias e principios j√° se definem como parte essencial da biologia sint√©tica, incluindo quatro principais t√≥picos: estrat√©gias bottom-up, top-down, algumas filosofias malucas sobre biobricks e aplica√ß√Ķes. Durante o curso, esses t√≥picos e seus respectivos objetivos foram distribu√≠dos abordados da seguinte forma:

(1)   Da complexidade natural à artificial;

Antes de desenvolver novos circuitos, √© preciso se entender a organiza√ß√†o e ‚Äúrobustez‚ÄĚ dos circuitos naturais. Integrar os dados de bancos de dados, assim como o montante de dados gerados por tecnologias de ‚Äúhigh throughput‚ÄĚ, que geram quantidades absurdas de dados, possibilitam observar com grande profundidade a din√Ęnica do genoma, transcriptoma, proteoma, metaboloma e suas intera√ß√Ķes. Como selecionar e aplicar essa montanha de informa√ß√£o origin√°ria da natureza e quais m√©todos devem ser utilizados para otimizar essas redes de informa√ß√£o em circuitos sint√©ticos?

(2)   Estratégias bottom-up;

Bottom-up, ou ‚Äúde baixo pra cima‚ÄĚ, √© a estrat√©gia usado pra construir coisas com legos: usar partes intercambiaveis e bem conhecidas que podem ser utilizadas para se desenvolver sistemas de diferentes complexidades (em contraposi√ß√£o a estrat√©gias top-down, onde mal se conhece o funcionamento do sistema, quanto mais sua complexidade, mas √© preciso regula-lo para combater doen√ßas, por exemplo). Esse jeito bottom-up de fazer synbio √© uma das areas mais revolucion√°rias em synbio, trazendo uma nova vis√£o open source de como produzir ci√™ncia. Assim, tem-se elevado, atrav√©s da constante caracteriza√ß√£o de novas partes biol√≥gicas, a complexidade e potencial de desenvolvimento de novos circuitos biol√≥gicos sint√©ticos pela utiliza√ß√£o desses legos biol√≥gicos.

(3)¬†¬† ‚ÄúLife is computation!‚ÄĚ;

Modelos físicos teóricos predizem e eu não entendo porra nenhuma com bastante precisão sistemas complexos, e tem ajudado a revelar mecanismos antes inimagináveis de controle de expressão gênica. Esses modelos ajudam a guiar o design de circuitos sintéticos e a otimiza-los.

(4)   Interfaces entre circuitos sintéticos e naturais;

Diferente da estrat√©gia bottom-up, alguns circuitos de interesse s√£o extremamente complexos, dependem de fatores externos ou suas ‚Äúpartes‚ÄĚ s√£o pouco conhecidas ‚Äď pelo menos com quanto as diferentes intera√ß√Ķes poss√≠veis. Uma estrat√©gia top-down, ‚Äúde cima pra baixo‚ÄĚ, permite regular sistemas biol√≥gicas sem que cada parte envolvida tenha sido ‚Äúreconstru√≠da‚ÄĚ ou, no m√≠nimo, seja totalmente conhecida como no caso de biobricks. Seria como desativar, ativar ou modular alguma parte pra ver se continua funcionando ou o que deixa de funcionar. E essa √© uma das grandes promessas e revolu√ß√Ķes do synbio: usar circuitos sint√©ticos em interface com circuitos complexos naturais para control√°-los ou modul√°-los.

Os participantes 

A organiza√ß√£o do curso foi feita pelos professores da Universidade de Buenos Aires Dr. Alejandro Nadra, o Dr. Ignacio Sanchez (o nacho!) e o Dr. Raik Gr√ľnberg, da Alemanha, todos advisors do primeiro time argentino do iGEM <http://igem.qb.fcen.uba.ar/site/#page_2/> e que vao ganhar um espa√ßo pr√≥prio num futuro post.

Os palestrantes, Dr. Marc G√ľell, pos doc no Church lab em Harvard, e a Dra. Reshma Shetty, co-fundadora da Ginkgo Bioworks¬†http://ginkgobioworks.com/, uma start up de synbio norte americana, falaram sobre a integra√ß√£o de bancos de dado e otimiza√ß√£o de redes naturais para se criar circuitos artificiais. O Dr. Drew Endy (primeiro coment√°rio: imagina um cara com cara de gringo, segundo: dizem por a√≠ que ele √© ‚Äúo pr√≥ximo steve jobs‚ÄĚ) co-fundador da BioBricks Foundation e um dos idealizadores do iGEM, falou sobre estrat√©gias bottom-up e biobricks¬†ohreally?. O Dr. Roman Jerala (o principal advisor do time da Slovenia que ganhou duas vezes o grand award do iGEM) e a Dra Chirstina Smolke (uma das principais pesquisadoras de switches de RNA e professora de bioengenharia em Stanford) falaram sobre modula√ß√£o de circuitos naturais usando estrat√©gias de top-down (DNA origami, riboswitches, prote√≠nas fusionadas) e o Dr. Thierry Mora e a Dra. Aleksandra Walczak¬†mostrou o que a Fran√ßa tem de melhor, ambos da Ecole Normale Sup√©rieure e do CNRS, falaram sobre modelagem te√≥rica de redes complexas e aspectos te√≥ricos do design de circuitos g√™nicos.

Mais informa√ß√Ķes:

http://events.embo.org/12-synthetic-biology/

A Incrível Sociedade dos Microrganismos


ResearchBlogging.org√Č bem √≥bvio que um ser humano n√£o existiria sozinho. N√£o s√≥ porque ele n√£o poderia ser gerado, mas porque dificilmente conseguiria sobreviver. J√° reparou na quantidade de pessoas que permitem (e permitiram) que voc√™ tivesse o dia de hoje como voc√™ tem? Cada parafuso, tecido, metal, tijolo e etc que permite voc√™ estudar, trabalhar, andar de autom√≥vel, comer e ler esse texto foram pensados, feitos, montados, transportados e vendidos por algu√©m. N√£o √© poss√≠vel portanto tentar entender os humanos, bem como a maneira com que eles se comunicam, isoladamente. √Č preciso olh√°-los sistemicamente, como seres sociais. As bact√©rias tamb√©m. √Č cada vez mais reconhecido que as bact√©rias n√£o existem como c√©lulas solit√°rias, mas s√£o como um “organismo colonizador” que elabora complexos sistemas de comunica√ß√£o que facilitam a sua adapta√ß√£o √†s recorrentes mudan√ßas ambientais. E elas nascem poliglotas. A sele√ß√£o natural esculpiu em diferentes esp√©cies diversos genes que as permitem se comunicar cooperativamente e repressivamente entre esp√©cies e at√© mesmo entre reinos (como por exemplo em bact√©rias patog√™nicas). Damos √† essa comunica√ß√£o bacteriana o nome de “quorum sensing” (“detec√ß√£o em qu√≥rum” – tradu√ß√£o livre).

Quorum Sensing

O termo “quorum sensing” foi cunhado devido √† habilidade dos microorganismos expressarem ou aumentarem a express√£o de certos genes quando em grande popula√ß√£o, podendo dessa forma monitorar a densidade celular (quantidade de c√©lulas ao seu redor) antes de manifestar algum fen√≥tipo. Um dos exemplos mais ilustrativos disso √© da Dictyostelium discoideum, um protozo√°rio que passa uma das fases do seu ciclo de vida produzindo um corpo multicelular. Tem um v√≠deo bem legal mostrando a forma√ß√£o de um corpo de frutifica√ß√£o atrav√©s de v√°rias c√©lulas individuais de Dictyostelium:

[youtube_sc url=http://www.youtube.com/watch?v=vjRPla0BONA]
Reparem rapidamente em 00:30 min as c√©lulas se locomovendo em “pulsos”, na dire√ß√£o de um local em que todas est√£o se agregando (√© dif√≠cil de perceber!). Esse local inicial √© em geral onde um grupo de bact√©rias encontrou alguma fonte de nutrientes. A “pulsa√ß√£o” da locomo√ß√£o das bact√©rias acontece devido √† subst√Ęncia de quorum sensing que √© difundida pelo espa√ßo vinda das c√©lulas do local de agrega√ß√£o; um pulso inicial provoca – quando em uma popula√ß√£o n√£o muito grande, para ser percept√≠vel – um comportamento oscilat√≥rio de resposta das c√©lulas: quando uma c√©lula recebe um sinal (do tipo “Ei, tem comida aqui!”), ela emite um de volta (como se etivesse gritando “Caramba, tem comida l√°!”), que √© recebido pelas c√©lulas que mandaram o sinal incialmente (o que seria um “√ďtimo! Estou indo pra√≠!”) e por outras ao seu redor, propagando o sinal. Como a transmiss√£o de informa√ß√£o com as subst√Ęncias n√£o √© imediata e nem totalmente cont√≠nua, observa-se os “pulsos”, que s√£o resultado do “gap” entre enviar e receber informa√ß√Ķes pela difus√£o de mol√©culas.

As diferentes Línguas das bactérias

Tabela com exemplos das diferentes fam√≠lias de subst√Ęncias de QS, as diferentes "l√≠nguas" das bact√©rias. Imagem modificada de S. Atkinson e P. Williams (2009) e de Y. He e L. Zhang (2008). Refer√™ncias no final do post.

As “l√≠nguas”, ou simplesmente certas coisas que as bact√©rias querem “dizer” (como “Estou afim de dar uma reproduzida!” ou “Fujam, eles est√£o vindo!”) s√£o “ditas” atrav√©s de diferentes tipos de subst√Ęncias que os microorganismos produzem. No caso da Dictyostelium ali em cima, a subst√Ęncia √© AMP c√≠clico (√© quase um ATP, s√≥ que duas vezes menos fosfatado… e c√≠clico, √© claro), mas se tratando de bact√©rias – que ainda √© a principal plataforma de aplica√ß√£o da Biologia Sint√©tica – existem tr√™s tipos principais de subst√Ęncias de quorum sensing: as acil-homoserinas lactonas (HSL ou AHL), auto-indutores 2 (AI-2) e pequenos √°cidos graxos, chamados de “DSF”s (Diffusible Signal Factor – do ingl√™s: Fator Sinalizador Difus√≠vel). Existem ainda outras fam√≠lias de subst√Ęncias de QS, mas aparentemente menos comuns que essas tr√™s principais.

O Mecanismo Gênico

A ativa√ß√£o dos sistemas de QS s√≥ ocorre em uma alta densidade celular. Isso permite que se chegue uma concentra√ß√£o limiar de subst√Ęncias de QS para express√£o de genes. 1, 2 e 3 s√£o os tr√™s elementos b√°sicos de DNA para se construir um sistema de QS. Imagem modificada de NA. Whitehead et al (2001), refer√™ncia no final do post.

Para um microrganismo ganhar a abilidade de “falar em outra l√≠ngua”, em geral s√£o necess√°rios apenas tr√™s elementos de DNA: um gene que gere uma enzima que produza uma subst√Ęncia de QS, outro gene que produza o “receptor” dessa subst√Ęncia – que em geral √© um fator de transcri√ß√£o – e um promotor, no qual o fator de transcri√ß√£o (ap√≥s se associar √† subst√Ęncia de QS) se liga para controlar a express√£o g√™nica (imagem ao lado).

Se uma bact√©ria (por exemplo) “fala” a mesma “l√≠ngua” que suas companheiras de col√īnia, como ela diferenciaria ent√£o um sinal pr√≥prio (a pr√≥pria subst√Ęncia de QS sendo produzida) de um sinal de outras c√©lulas (subst√Ęncia de QS externa)!? Isso √© importante, porque se a bact√©ria receber o pr√≥prio sinal que envia, ela entrar√° em um processo autocatal√≠tico que resultar√° em uma cont√≠nua auto-ativa√ß√£o da c√©lula independente do sinal das bact√©rias ao seu redor. Acontece que uma bact√©ria n√£o produz n√≠veis suficientes de QS para “se ouvir”. Sem o sinal externo, a transcri√ß√£o de genes pelo sistema de quorum sensing √© fraca e insuficiente para iniciar um feedback positivo; apenas em alta densidade celular se consegue alcan√ßar uma concentra√ß√£o cr√≠tica de subst√Ęncias de QS para estimular a transcri√ß√£o dos genes que o QS controla.

Quorum Sensing no iGEM

Apesar de n√£o ser um meio de transmiss√£o de informa√ß√£o t√£o r√°pido e eficiente como o dos light switches, os sistemas de QS s√£o bastante utilizados em dispositivos sint√©ticos devido √† sua especificidade e falta de “falsos sinais” – afinal, √© extremamente f√°cil estimular n√£o-intencionalmente uma c√©lula sens√≠vel √† luz. No Registry of Parts existem cerca de 6 sistemas de QS¬†completos, padronizados e dispon√≠veis para constru√ß√£o, todos usando (em geral) diferentes AHLs, usados tanto na ativa√ß√£o e inibi√ß√£o da express√£o de genes.

Exemplos de utiliza√ß√£o desse sistema de transmiss√£o de informa√ß√£o n√£o faltam no iGEM. J√° tratamos no blog de um dos in√ļmeros projetos do iGEM que utilizam quorum sensing, o da Unicamp de 2009. Em seu projeto, o time brasileiro utilizou sinais de AI-2 como um “sistema de alerta” em bact√©rias produtoras de bioprodutos em um bioreator. Quando um microrganismo contanimante surgisse (produzindo AI-2), o sistema de QS atuaria para comunicar sua presen√ßa a todas as bact√©rias ao redor do organismo invasor, iniciando gatilhos g√™nicos para produ√ß√£o de subst√Ęncias nocivas ao contaminante, afim de extermin√°-lo do bioreator.

Parte do vídeo explicativo do time da Unicamp de 2009. Uma pequena esquematização de como usaram quorum sensing.

Aprender como uma popula√ß√£o de microrganismos de comunica √© extremamente √ļtil para saber como ela se comporta, e no caso da biologia sint√©tica, muito √ļtil para conseguir controlar esse comportamento para transmitir informa√ß√Ķes em um dispositivo g√™nico sint√©tico. Mas √© claro que prever todo um comportamento de um sistema biol√≥gico n√£o √© nada f√°cil. Como j√° salientava Asimov, h√° algo em comum no comportamento de humanos e √°tomos: ambos s√£o muito previs√≠veis singularmente, mas praticamente ca√≥ticos quando em coletivo. Apesar de mais simples, popula√ß√Ķes de microrganismos tamb√©m se comportam assim, o que √© uma das raz√Ķes que tornam o trabalho em laborat√≥rio muitas vezes frustante e cansativo. Um guia nesse caos √© essa compreens√£o sist√™mica da comunica√ß√£o entre bact√©rias (que origina certas resist√™ncias a antibi√≥ticos inesperadas e outras coisas bizarras), que assim como seres humanos, as torna seres mais sociais do que voc√™ possa imaginar.

Referências

  1. Whitehead, N. (2001). Quorum-sensing in Gram-negative bacteria FEMS Microbiology Reviews, 25 (4), 365-404 DOI: 10.1016/S0168-6445(01)00059-6
  2. Atkinson, S., & Williams, P. (2009). Quorum sensing and social networking in the microbial world Journal of The Royal Society Interface, 6 (40), 959-978 DOI: 10.1098/rsif.2009.0203
  3. He YW, & Zhang LH (2008). Quorum sensing and virulence regulation in Xanthomonas campestris. FEMS microbiology reviews, 32 (5), 842-57 PMID: 18557946

 

SB 5.0 РEncontro Internacional de Biologia Sintética e um breve histórico

Em julho do ano passado, cientistas do J. Craig Venter Institute¬†‚Äúcriaram‚ÄĚ a primeira c√©lula bacteriana sint√©tica e auto-replicante, controlada por um genoma quimicamente sintetizado e o an√ļncio foi feito em maio (veja o v√≠deo abaixo). A equipe sintetizou um cromossomo de 1,08 milh√Ķes de pares de bases a partir de um genoma modificado de Mycoplasma mycoides. A c√©lula sint√©tica recebeu o nome de Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 e √© a prova de que genomas podem ser¬†desenhados¬†(no sentido de designed)¬†em computadores, depois sintetizados quimicamente em um laborat√≥rio e inseridos em uma c√©lula, de forma a produzir uma nova c√©lula auto-replicante controlada apenas por um genoma sint√©tico.

[youtube=http://www.youtube.com/watch?v=QHIocNOHd7A&feature=player_embedded]

A not√≠cia se espalhou pelo mundo em pouco tempo, ganhando fama, criando pol√™mica e dividindo opini√Ķes a respeito dos riscos e benef√≠cios potenciais de sua descoberta. Em resposta, o Presidente Barack Obama pediu para a “Presidential Commission for the Study of Bioethical Issuesavaliar o desenvolvimento e a √©tica da biologia sint√©tica e tecnologias emergentes, de forma a maximizar os benef√≠cios e minimizar os riscos. A Comiss√£o contou com o engajamento de cientistas, engenheiros, profissionais ligados √† √©tica, ci√™ncias sociais.

Agora em junho, cerca de 700 pessoas de 30 países participaram do 5ª Encontro Internacional de Biologia Sintética na Universidade de Stanford, que pelo que me parece é o mais importante nessa área. Havia cientistas superstars, estudantes, biólogos DIY, engenheiros, biólogos tradicionais, entre outros. O pessoal que segue nosso twitter ou a página do facebook ficou sabendo que a conferência foi transmitida ao vivo pela internet e viu como esse pessoal está batalhando para dar os próximos passos na synbio.

A cria√ß√£o da c√©lula sint√©tica abre portas para um futuro no qual bi√≥logos sint√©ticos poder√£o ‚Äúredesenhar‚ÄĚ (redesign) c√©lulas vivas para realizarem quaisquer tarefas desejadas. A maior parte das pesquisas atuais tem focado em bact√©rias que executam atividades semelhantes √†quelas que elas j√° fazem, por meio de processos e materiais que se parecem com aqueles utilizados naturalmente. Exemplos s√£o bact√©rias produtoras de combust√≠veis.

Os cientistas t√™m as ferramentas necess√°rias para editar uma sequ√™ncia gen√©tica existente em um computador, usar m√°quinas sintetizadoras de DNA para fabricar os fragmentos e uni-los em laborat√≥rio (Esse √© s√≥¬†um de v√°rios caminhos que bi√≥logos sint√©ticos est√£o tomando.) Mas ainda √© dif√≠cil predizer o que as c√©lulas far√£o depois de serem alteradas. Pesquisadores enfrentam desafios porque as c√©lulas tem um ‚Äúdesejo natural‚ÄĚ de crescerem e viverem √† sua maneira, mas elas precisam aprender a produzir algo √ļtil de uma forma eficiente.

Um dos maiores obstáculos reside na criação e montagem dos fragmentos de DNA que codificam para uma função particular e são sintetizados no laboratório. Fabricar esse DNA ainda é caro e requer tempo, e qualquer outra mudança que seja necessária demanda ainda mais tempo e dinheiro.

‚ÄúAlgumas sequ√™ncias s√£o sintetizadas em dois meses”, enquanto outras podem nem mesmo serem feitas, por raz√Ķes ainda n√£o entendidas, disse Reshma Shetty, co-fundadora do Ginkgo Bioworks, uma companhia que monta partes de DNA.

Pamela Silver, uma professora de biologia de sistemas da Universidade de Harvard, acredita que os biólogos do futuro poderão sentar na frente de um computador, planejar um experimento, e ter o DNA no dia seguinte. Para que a biologia sintética cumpra sua promessa, a síntese de DNA deve ser barata, rápida, previsível e acurada, além de ser disponível a todos, incluindo pesquisadores cujos laboratórios não tem equipamentos ou recursos apropriados. Felizmente, o custo da síntese de DNA, assim como o do sequenciamento de DNA, vem caindo rapidamente.

Retirado e adaptado de: What’s the Future of Synthetic Biology? por Katherine Bourzac

Para Saber Mais:

The Promise of Syn Bio (version 5.0)

First Self-Replicating, Synthetic Bacterial Cell Constructed by J. Craig Venter Institute Researchers 

Immaculate creation: birth of the first synthetic cell

[twitter-follow screen_name=’MnlimasBio’]

Secretaria de Partes Biológicas Padrão

J√° comentei em posts anteriores sobre os Biobricks, as partes biol√≥gicas padr√£o da biologia sint√©tica. Dentro desse contexto, foi fundado em 2003, no MIT,¬†a Secretaria de Partes Biol√≥gicas Padr√£o (Registry of Standard Biological Parts) para depositar as partes gen√©ticas utilizadas na montagem de dispositivos e sistemas sint√©ticos. A secretaria cont√©m mais de 3400 partes que podem ser trocadas por in√ļmeros laborat√≥rios cadastrados e espera-se que todos contribuam com dados e novas partes para melhorar o reposit√≥rio.

A secretaria oferece muitos tipos de partes biol√≥gicas, incluindo plasm√≠deos, primers, promotores, dom√≠nios de prote√≠nas, s√≠tios de liga√ß√£o de ribossomos, riborreguladores, genes rep√≥rteres e etc… (veja a lista).

Entre os objetivos de criação do Registro estão: (i) possibilitar a engenharia sistemática da biologia, (ii) promover o desenvolvimento transparente e aberto de ferramentas de engenharia biológica e (iii) para construir uma sociedade que, produtivamente e democraticamente, possa aplicar tecnologias biológicas.

Atualmente mais de 120 laborat√≥rios do mundo inteiro pertencem¬†√† comunidade dos Biobricks. Este ano, o Laborat√≥rio de Bioprodutos da USP foi o primeiro laborat√≥rio do pa√≠s a¬†fazer parte dessa comunidade. Algumas das nossas constru√ß√Ķes gen√©ticas j√°¬† est√£o sendo feitas em formato biobrick para que possamos receber partes e contribuir com partes tamb√©m. Na pr√≥xima segunda, receberemos uma das respons√°veis pela Secret√°ria, Meagan Lizarazo que ir√° dar uma palestra sobre biologia sint√©tica, biobricks, iGEM e outros assuntos relacionados.

N√£o percam esta oportunidade!

BioBricks: fabricação de pequenos fragmentos de DNA

Este protocolo é utilizado para a fabricação de BioBricks pequenos, como promotores ou sítios de ligação do ribossomo (RBS). Para isso, utiliza o anelamento e extensão dos primers para criar um pequeno fragmento de DNA (~ 100 bp) utilizando Taq polimerase de alta fidelidade. O fragmento de DNA pode ser imediatamente utilizado em uma reação de clonagem utilizando TOPO-TA. Caso se deseje realizar uma etapa de digestão do fragmento de DNA, uma etapa de purificação de produto de PCR é necessária.

Materiais:

– Dois primers que se sobrep√Ķe por ~20 bp.

Primer¬†1: ¬†¬†¬†5′ ———————————– 3′
Primer¬†2: ¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†3′ ———————————– 5′

Mix para PCR Taq alta fidelidade

Método

1. Diluir os dois oligos a uma concentra√ß√£o de 25 őľM utilizando H2O. Para primers¬†maiores que 50-60¬†bp podem ocorrer problemas como erros e dele√ß√Ķes, por isso,¬†pode valer a pena incluir uma etapa de purifica√ß√£o extra PAGE (Invitrogen).

2. Misturar os reagentes em um tubo estéril de 0.6 mL:

  • 9 őľL PCR supermix
  • 0.5 őľL¬†primer 1
  • 0.5 őľL¬†primer 2

3. A reação de anelamento e extensão dos primers ocorrem no termociclador segundo o seguinte protocolo:

  1. 94¬įC¬†por 5 mins
  2. 94¬įC¬†por 30 seconds
  3. 55¬įC¬†por 30 seconds (ou qualquer outra temperatura de anelamento)
  4. 72¬įC¬†por 30 seconds
  5. Repita os passos 2-4 por 2-3 ciclos
  6. 72¬įC¬†por 5 mins

4. Utilize 1őľL de produto de PCR fresco (feito no mesmo dia) numa rea√ß√£o de clonagem com TOPO TA cloning.

Para desenhar um BioBrick por esse método não se esqueça de colocar o prefixo e sufixo dos BioBricks nos primers. Pronto, já descrevemos os protocolos para desenhar e montar um circuito sintético com promotores, RBS e genes.

Boa sorte e¬†qualquer d√ļvida, por favor, pergunte!

Referências

Stemmer WP, Crameri A, Ha KD, Brennan TM, and Heyneker HL. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene 1995 Oct 16; 164(1) 49-53. pmid:7590320. PubMed HubMed PubGet [Stemmer-Gene-1995].

http://openwetware.org/wiki/Knight:Annealing_and_primer_extension_with_Taq_polymerase

BioBricks: fabricação de uma parte padrão.

At√© agora comentamos sobre a possibilidade de juntar diferentes componentes utilizando o padr√£o t√©cnico de montagem dos BioBricks. Mas neste post vou comentar sobre a fabrica√ß√£o de uma parte padr√£o. No futuro, eu¬†pretendo comentar sobre a s√≠ntese de DNA sint√©tico, mas agora¬†vou explicar como montar um BioBrick utilizando o m√©todo de PCR. O aparelho para realizar um PCR, o termociclador,¬†est√°¬†presente na maioria dos laborat√≥rios de biologia molecular, e hoje se apresenta como uma ferramenta b√°sica para este tipo de atividade. Existem centenas de livros e sites na Internet que podem te familiarizar com a t√©cnica. Primeiramente, um BioBrick¬†pode ser constru√≠do via PCR se existe algum molde de DNA do qual o BioBrick¬†possa ser amplificado (por ex., um gene de alguma bact√©ria)¬†ou se a parte √© pequena o suficiente que possa ser criada atrav√©s do alinhamento e extens√£o do primer (iniciador). Nos dois casos √© necess√°rio adicionar na extremidade 5′ dos primers as sequ√™ncias referentes aos s√≠tios das enzimas de restri√ß√£o presentes nos BioBricks, os sufixos e prefixos (ver post anterior).

A constru√ß√£o de BioBricks contendo sequ√™ncias codificadoras de prote√≠nas requer um sufixo e um prefixo um pouco mais especializados por duas raz√Ķes:

1. o prefixo é alterado para garantir o espaçamento entre o sítio de ligação do ribossomo e o códon ATG de início.

2. BioBricks que codificam proteínas possuem, por padronização, dois códons de sequência TAA de parada.

Ao¬†construir os primers, basicamente, √© necess√°rio “copiar e colar” a seguinte sequ√™ncia de¬†31 bp¬†no fim 5′ no seu primer upstream (ou iniciador universal) desenhado para o seu fragmento de DNA de interesse:

5′ —> 3′
GTT TCT TCG AAT TCG CGG CCG CTT CTA G ATG…
start codon (no caso de um gene)
E “copiar e colar” os seguintes 35 bp no fim 5′ do seu primer downstream (iniciador reverso):

5′ —> 3′
GTT TCT TCC TGC AGC GGC CGC TAC TAG TA TTA TAA….
duplo stop codon!

A estas sequências deve-se somar aproximadamente 20 bp de sequência de primer relativa a região codificadora. Para este tipo de clonagem se utiliza uma Taq polimerase com alta fidelidade e um kit de clonagem TOPO-TA cloning.

Claro que todas as outras precau√ß√Ķes para se desenhar um primer ainda s√£o v√°lidas, como a verifica√ß√£o de s√≠tios de restri√ß√£o nas sequ√™ncias. Para mais detalhes, veja o protocolo disponibilizado para a fabrica√ß√£o de BioBricks.