Mais um acidente a favor do pesquisador

Em 1986, o pesquisador Richard Jorgensen estava trabalhando com pet√ļnias quando aconteceu um acidente. Jorgensen desejava criar uma pet√ļnia roxa, por√©m muito mais roxa do que o normal. Para alterar a cor, ele procurou super-expressar a enzima chalcona-sintase (CHS) introduzindo um gene quim√©rico de CHS, uma enzima limitante da via respons√°vel pela colora√ß√£o das flores [1]. Mas a altera√ß√£o gen√©tica realizada teve um resultado totalmente inesperado e grande parte das p√©talas se tornaram brancas e n√£o roxo escuro como ele desejava.

O mist√©rio s√≥ foi desvendado em 1998 e conferiu o Pr√™mio Nobel a dois pesquisadores americanos, gerou especula√ß√Ķes sobre a cura de dezenas de doen√ßas e mais recentemente se tornou uma nova ferramenta para a biologia sint√©tica.¬†Andrew Fire e Craig Mello descobriram que Jorgensen havia esbarrado no que eles vieram a chamar de RNA de interfer√™ncia (RNAi), um mecanismo de silenciamento g√™nico.

O gatilho para o mecanismo de silenciamento gênico por RNAi ocorre quando um RNA de dupla fita (dsRNA) se forma. Ao ser identificado um dsRNA, a enzima Dicer corta o dsRNA em fragmentos menores que se ligam ao complexo protéico RISC (RNA-induced silencing complex). Em seguida, apenas uma das fitas de RNA permanece presa ao complexo, que serve para ir em busca de fitas de mRNA que sejam complementares [2]. Quando um mRNA complementar é detectado, ocorre o pareamento com o RNA preso ao complexo e ele é então clivado e degradado. Como o mRNA não pode ser traduzido, o gene tem sua expressão reduzida (Figura 1). O silenciamento é uma poderosa ferramenta que agora encontrou uma aplicação na biologia sintética, por meio da evolução dirigida.

O sonho da biologia sint√©tica de construir sistemas que funcionem de modo previs√≠vel e robusto frequentemente entra em conflito com a complexidade dos sistemas biol√≥gicos. Al√©m de sua complexidade, o comportamento dos microrganismos dependem de um contexto, o que tamb√©m dificulta o uso de partes padronizadas [3]. Logo, m√©todos de evolu√ß√£o dirigida possuem grande utilidade, j√° que em princ√≠pio dispensam informa√ß√Ķes detalhadas de estrutura, funcionalidade e de mecanismos de um sistema [4].

 

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Figura 1: Mecanismo do RNAi – Imagem retirada de: http://pt.wikipedia.org/wiki/RNA_interferente

 

 

Um dos primeiros experimentos sobre evolu√ß√£o realizado em laborat√≥rio foi feito por¬† William Dallinger, em 1880. Dallinger conseguiu que seus microrganismos que cresciam a 18¬ļC passassem a crescer a 70¬ļC, no entanto o experimento levou 7 anos e envolveu¬† aumentar a temperatura de sua incubadora gradualmente at√© que eles fossem capazes de sobreviver. Hoje existem diversos m√©todos de evolu√ß√£o dirigida e um pouco menos demorados, entre eles o RAGE ‚Äď RNAi assisted genome evolution.

RAGE √© um m√©todo utilizado em Saccharomyces cerevisiae e √© bastante √ļtil quando se deseja obter fen√≥tipos complexos. Fen√≥tipos complexos, como a toler√Ęncia ao √°cido ac√©tico, dependem da altera√ß√£o de m√ļltiplos genes e s√£o de grande interesse para a ind√ļstria na produ√ß√£o de combust√≠veis e outros compostos qu√≠micos. O uso dessa t√©cnica reduz a express√£o de genes (knockdown) em escala gen√īmica e possibilita identificar genes que at√© ent√£o n√£o se imaginava terem papel em determinadas fun√ß√Ķes.

Para que tais genes possam ser identificados, √© necess√°rio criar uma biblioteca de RNAi. A biblioteca √© criada fragmentando o DNA gen√īmico com uma enzima de restri√ß√£o e clonando os fragmentos em um plasm√≠deo com promotores convergentes, necess√°rio para que RNAs de fita dupla sejam formados. Como S. cerevisiae n√£o possui a via de RNAi, tamb√©m √© necess√°rio inseri-la [6].

Via inserida e biblioteca criada o processo de evolução pode começar. Quando o knockdown de um gene for promissor, tal gene pode ser integrado e novos ciclos de transformação e screening podem ser feitos repetidamente (Figura 2), até que seu objetivo seja alcançado, ou pelo menos, chegue próximo dele.

 

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Figura 2: Evolução dirigida pelo método RAGE РImagem retirada de: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/sb500074a

 

Em 2006, Fire e Melo ganharam o Pr√™mio Nobel em fisiologia ou medicina por desvendarem o fen√īmeno observado por Jorgensen. Muitas descobertas acidentais fazem parte da hist√≥ria da ci√™ncia, como a penicilina, o raio X e o microondas, por exemplo. O m√©todo de evolu√ß√£o dirigida utilizando RNAi pode tamb√©m em breve facilitar a vida de muitos pesquisadores que buscam aprimorar seus microrganismos.

 

 

Referências

  1. NAPOLI, C.; LEMIEUX C.; JORGENSEN R. lntroduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. The Plant Cell, Vol. 2, p. 279-289.
  1. CLARK D. P. Molecular Biology. Vol. 2, chapter 11 (2010)
  1. DOUGHERTY, M. J.; ARNOLD, F. H. Directed evolution: new parts and optimized function. Current Opinion in Biotechnology, 2009, 20:1‚Äď6
  1. COBB, R. E; SUN,N.; ZHAO H. Directed evolution as a powerful synthetic biology tool. Methods (2012)
  1. SI, T.; LUOZ, Y.; BAO, Z.; ZHAO, H. RNAi-Assisted Genome Evolution in Saccharomyces cerevisiae for Complex Phenotype Engineering. ACS Synth. Biol. (2014)

 

 

Deixem os radicais serem livres

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Eu tenho um amigo artista¬†que adora ver fractais¬†nas coisas – esses padr√Ķes que se repetem na natureza entre escalas macro e micro, sabe!? Esse meu amigo me fez pensar num fractal que beira uma piada infame: os radicais livres.

O escritor de sci-fi Isaac Asimov j√° fez compara√ß√£o parecida de popula√ß√Ķes humanas e de mol√©culas¬†e at√© que faz algum sentido. Pense bem: os radicais pol√≠ticos da nossa sociedade s√£o como mol√©culas inst√°veis, altamente reativas, cujas opini√Ķes e atitudes conseguem se alastrar rapidamente, colocando fogo em mentes e cora√ß√Ķes – e eventualmente em coisas. Em certo sentido poderia se dizer tamb√©m que frequentemente s√£o “fogo-de-palha”: o radicalismo disseminado se aquieta t√£o r√°pido quanto se alastra, com uma √°rea de a√ß√£o limitada. Em ambos os casos chamamos esses “altamente reativos e inst√°veis” sujeitos de “radicais livres”.

Radicais Livres versus Radicais Livres

Da mesma maneira que um radical pol√≠tico √© aquela pessoa que se torna “extrema” por carregar a convic√ß√£o muito forte de que h√° algo muito estranho na sociedade, os radicais livres tamb√©m t√™m algo incomum que os deixa extremamente reativos: el√©trons. Quando uma mol√©cula fica com um el√©tron desemparelhado (geralmente por quebra homol√≠tica de liga√ß√Ķes) ela se torna um radical, uma mol√©cula que n√£o est√° dentro da regra do octeto¬†e que por isso com muita pouca energia √© capaz de reagir com outras mol√©culas, formando novos radicais – igual seres humanos, s√≥ que com regras bem mais complexas.

Radicalizando contra os radicais

Como deu para perceber com os amigos e familiares com quem voc√™ talvez tenha brigado nessas √ļltimas elei√ß√Ķes, radicais geram radicalismos tamb√©m na “dire√ß√£o oposta”. Se a natureza √© uma das principais fontes de radicais livres, o radicalismo oposto √© a vida, que conseguiu sobreviver a opressores raios UV, raios gamma e os mais variados compostos oxidativos at√© se diversificar e milh√Ķes de anos depois acabar sendo capaz de ler esse texto. Talvez o melhor exemplo desse radicalismo anti-oxidativo que a vida se tornou s√£o as bact√©rias do g√™nero Deinococcus.

Deinococcus_radiodurans

Essa é a carinha da Deinococcus radiodurans.

Uma das bact√©rias mais famosas desse g√™nero √© a Deinococcus radiodurans, que sobrevive a uma quantidade de radia√ß√£o gamma (a mesma que gerou o √ćncr√≠vel Hulk) 20000 vezes maior do que a permitida para astronautas em miss√Ķes espaciais – e sem se tornar uma mutante. Isso s√≥ √© parte da grande caracter√≠stica das bact√©rias do g√™nero Deinococcus de “radicalizar” na prote√ß√£o a danos moleculares. No dano causado por radicais livres (danos oxidativos), que pode ser um efeito indireto da a√ß√£o dos raios gamma, as esp√©cies de Deinococcus possuem estrat√©gias que v√£o al√©m das usuais para se proteger de radicais livres: esses seres vivos diminuem seu tamanho celular eliminando √°gua; com menos √°gua, menor a probabilidade de se gerar esp√©cies reativas de oxig√™nio provenientes das mol√©culas de H2O, al√©m de “concentrar” o citosol de mol√©culas respons√°veis por reagir e “conter” esses radicais livres – sim, os antioxidantes – que existem em grande quantidade nas Deinococcus.

No ponto de vista de “engenheirar” solu√ß√Ķes biotecnol√≥gicas, entender os extremos √© uma maneira importante de entender como as coisas “normais” funcionam, e como podemos resolver problemas com esse conhecimento. √Č um jeito de entender a n√≥s mesmos. O mesmo vale para os radicais pol√≠ticos.

Radicais livres, “malvados” e naturais

Igual ao termo “black block”, os radicais livres qu√≠micos tamb√©m j√° s√£o populares. Hoje √© muito f√°cil encontrar embalagens de cosm√©ticos e de “alimentos saud√°veis” com os termos “antioxidantes naturais” que inibem os “radicais livres” – essas coisinhas qu√≠micas malvadas. A associa√ß√£o dos radicais livres com algo ruim √© natural porque est√£o intimamente relacionados com o envelhecimento e o c√Ęncer [3] – duas coisas muito cotadas para ganhar dinheiro de pesquisa, inclusive se for para estudar isso nas Deinococcus.

Al√©m de produzidos por radia√ß√£o, eles s√£o produtos naturais do nosso metabolismo aer√≥bio [4]. Desde quando a atmosfera terrestre passou a se tornar oxidante (por causa do oxig√™nio, h√°!) h√° milh√Ķes de anos [1], a vida come√ßou a se tornar esse joguinho cada vez mais complexo de conduzir el√©trons atrav√©s de mol√©culas estranhas. √Č como um circuito eletr√īnico, em que os caminhos de condu√ß√£o devem estar isolados uns dos outros para evitar curto-circuito e o dispositivo realizar sua fun√ß√£o. A c√©lula √© como um circuito com um isolamento quase perfeito, e √© essa pequena falta de isolamento que faz os el√©trons irem aonde n√£o devem, formando radicais livres [1].

Parte da “fun√ß√£o” desse fluxo eletr√īnico da c√©lula, no final das contas, √© armazenar informa√ß√£o. Voc√™ n√£o √© apenas um agregado aleat√≥rio de mol√©culas, voc√™ √© um agregado de mol√©culas com uma certa ordem e arranjo espec√≠ficos, e isso √© informa√ß√£o. O envelhecimento √© causado por perda dessa ordem ao longo do tempo, e os maiores culpados disso at√© agora s√£o os radicais livres. Eles reagem com o DNA podendo causar muta√ß√Ķes e est√£o associados diretamente com o encurtamento dos tel√īmeros [3]¬†(que √© uma esp√©cie de “medida” de idade celular). Essa perda de informa√ß√£o se d√° at√© de outra maneira (ainda mais literal) com a a√ß√£o dos radicais livres em prote√≠nas, como no caso do Alzheimer. Nesse caso os radicais livres contribuem para a forma√ß√£o de agregados proteicos t√≥xicos nas c√©lulas do c√©rebro, associados com o desencadeamento da doen√ßa.

O bom é o equilíbrio

Apesar da doen√ßa de Alzheimer, radicais livres no c√©rebro n√£o geram apenas danos. O radical livre √≥xido n√≠trico (NO) por exemplo, √© um neurotransmissor regulador cardiovascular muito potente – tanto que o Viagra interfere no mecanismo de regula√ß√£o mediado naturalmente pelo NO para ter seu efeito. A vis√£o dos radicais livres como simplesmente vil√Ķes come√ßou a mudar com o radical super√≥xido¬†(mol√©cula de oxig√™nio com um el√©tron a mais) que deixou de ser considerado meramente como um subproduto nocivo do metabolismo para ser uma das pe√ßas fundamentais na bioqu√≠mica do sistema imunol√≥gico. Hoje sabemos que v√°rios genes s√£o diretamente regulados por a√ß√£o de radicais livres que interagem com fatores de transcri√ß√£o para a ativa√ß√£o e/ou inibi√ß√£o da express√£o g√™nica [3], em outras palavras: os radicais livres n√£o s√£o meras fontes de dano que levam √† morte, mas est√£o profundamente ligados com a pr√≥pria regula√ß√£o da vida em si.

Indo de volta para a vis√£o macro do nosso “fractal”, os radicais pol√≠ticos teriam papel semelhante: s√£o mais do que membros “extremistas”. Eles est√£o ligados profundamente com a regula√ß√£o da pr√≥pria pol√≠tica¬† em si. S√£o, assim como os radicais livres qu√≠micos, algo do que a sociedade precisa se proteger mas ao mesmo tempo algo que faz parte do seu pr√≥prio sistema imunol√≥gico. S√£o os radicais que chamam a aten√ß√£o, seja para a direita ou para a esquerda, de que algo precisa ser debatido. S√£o os vistos como “radicais” que t√™m a coragem de entrar no campo cinzento da moralidade para redefini-lo com o tempo. Sobretudo, s√£o os radicais que s√£o a melhor indica√ß√£o da sa√ļde pol√≠tica: havendo um certo equil√≠brio e limites, s√£o a caricatura de uma pluralidade e flexibilidade pol√≠tica que uma democracia precisa ter.

Esse √© o meu ponto como advogado-do-diabo dos radicais livres. Precisamos entend√™-los como sujeitos de um equil√≠brio natural. Por isso, assim como √© errado chamar qualquer manifestante de “black block” sem ao menos saber o que √© isso, √© tamb√©m errado para radicais livres espec√≠ficos cham√°-los de “ROS” (reactive species of oxygen) sem saber direito o que de fato esses radicais fazem. √Č como a pesquisadora principal do CEPID Redoxoma, Ohara Augusto, menciona na newsletter do grupo:

…abrevia√ß√Ķes s√£o √ļteis quando t√™m significados espec√≠ficos. ROS n√£o √© verdadeiramente uma abrevia√ß√£o porque agrupa mol√©culas com propriedades qu√≠micas e biol√≥gicas completamente diferentes.

Ou seja: é errado colocar tudo num mesmo saco porque isso pode acabar atrapalhando o entendimento das coisas. Assim como posicionamentos políticos podem ter os mais variados espectros, os radicais livres podem ter as mais diferentes reatividades, estruturas e fontes de produção Рtornando-os na prática bem diferentes uns dos outros (veja na figura abaixo).

Tabela reatividade radicais

Todos s√£o “radicais”, mas com reatividades bem diferentes.

Bons ou maus, √ļteis ou in√ļteis, tudo isso depende do contexto, e o principal contexto √© entend√™-los melhor, saber como eles funcionam – sendo radicais qu√≠micos ou pol√≠ticos. Por isso, vamos parar de achar que a exist√™ncia de radicais √© algo errado. Independentemente do que achamos deles, a natureza √© muito mais do que esse preto-no-branco. Ela √© livre para ser esse incr√≠vel caos organizado – ent√£o deixem os radicais serem livres tamb√©m!

Referências

[1] McCord, Joe M. “The evolution of free radicals and oxidative stress.” The American journal of medicine 108.8 (2000): 652-659.

[2] Slade, Dea, and Miroslav Radman. “Oxidative stress resistance in Deinococcus radiodurans.” Microbiology and Molecular Biology Reviews 75.1 (2011): 133-191.

[3] Kim, Hyon Jeen, et al. “Modulation of redox-sensitive transcription factors by calorie restriction during aging.” Mechanisms of ageing and development 123.12 (2002): 1589-1595.

[4] Ohara Augusto and Sayuri Miyamoto. “Oxygen Radicals and Related Species”. Principles of Free Radical Biomedicine. Vol. 1, chapter II (2011).