Como montar o seu próprio laboratório de garagem?
Aqui no SynBio Brasil já foi comentado sobre a onda cada vez mais crescente de pessoas desenvolvendo seus próprios experimentos de Biologia Sintética em suas garagens, o DIYBio. Mas quais são os equipamentos necessários (e mais baratos) para montar o seu próprio laboratório? A revista Nature publicou uma reportagem no ano passado sobre esse assunto e identificou os seguintes equipamentos que não podem faltar em um laboratório de SynBio de garagem:
Equipamentos básicos:
1) Pipetas ($275 – $630): Servem para a aplicação de substâncias com volume controlado
2) Freezer -20ºC ($180 – $500): Serve para refrigerar amostras, culturas, enzimas, etc.
3) Equipamento para corridas de gel ($115 – $190): Identificar e separar fragmentos de DNA ou RNA
4) Shaker ($50 – $400): Serve para misturar soluções
5) Balança ($5 – $3,000): Serve para medir massas
6) Chapa de aquecimento ($100 – $200): Serve para o aquecimento de
soluções
Equipamentos que podem ser improvisados:
1) Autoclave ($250 – $2,000): Esteriliza soluções e materiais
2) Microcentrífuga ($60 – $850): Centrifuga soluções
3) Incubador ($100 – $800): Mantém amostras aquecidas
4) Termociclador ou Máquina de PCR ($195 – $1,000): Faz ciclos de
amplificação de segmentos de DNA
Equipamentos que exigem um investimento alto:
1) Exaustor ($500 – $7,000): Mantém a bancada estéril e livre de
gases tóxicos
2) HPLC ($2,000 – $54,000): Qualifica e quantifica substâncias de
uma amostra
3) Espectrômetro UV/VIS ($180 – $3,000): Quantifica e define a pureza em que uma substância está em uma amostra
Além disso, eu incluiria um pHmetro ($30 – $800), pois é muito importante para a confecção de alguns meios de cultura manter as
condições de pH adequadas ao organismo que será cultivado; além de um microscópio, útil para identificar coisas básicas como o tipo celular que está crescendo em sua cultura, com base na forma ou colorações de Gram.
Para alguns, o preço de certos equipamentos pode parecer um empecilho muito grande no desenvolvimento de um laboratório de garagem, mas a revista mostra exemplos de “Biohakers” que buscaram financiamento para suas pesquisas através de sites solicitando doações com base em seus projetos como o Kickstarter. Outra opção é se unir aos “Engenheiros de Garagem” e montar seus próprios equipamentos! Segundo a revista, é possível fazer um microscópio de $10 adaptando-se a lentes de uma webcam, ou até mesmo dispensar um incubador e aquecer amostras nas próprias axilas (eu mesmo já cheguei a aquecer amostras congeladas de Taq polimerase com as próprias mãos!!!). No Brasil, um bom começo para esse tipo de parceria é a rede social Laboratório de Garagem em que pessoas trocam informações sobre diversas formas de se construir equipamentos com baixo custo.
Com todas essas informações, não há desculpas para os Biólogos de Plantão começarem a botar a mão na massa!!!
Portas Lógicas em Sistemas Gênicos
A associação da biologia sintética com a eletrônica é bem grande. A semelhança entre a interação de enzimas, fatores de transcrição e DNA, e circuitos elétricos gera uma interessante conexão interdisciplinar entre engenharia elétrica e biologia, tanto que os próprios fundadores do iGEM e do registry of parts são engenheiros elétricos!
Algumas boas analogias, ou melhor, interpretações dos sistemas gênicos, são feitas com o uso de portas lógicas para classificar o comportamento das interações gênicas. Portas lógicas baseiam-se na lógica booleana, usada largamente em computação. Para entender melhor, vamos ver uns dois exemplos: o NOR e AND.
NOR (“not OR”, o inverso do resultado para a porta OR, conhecido também como NEM):
Imagem retirada e modificada da referência (Khalil, A., & Collins, J.).
Como já foi mostrado aqui no blog, esse dispositivo possui dois estados estáveis que podem ser ligados ou desligados através de inputs específicos. Retirando esse input, no caso sinais exógenos como calor e IPTG, o sistema preserva o seu estado, criando assim uma forma molecular não exclusivamente estrutural (i.e. conformação de proteínas e etc) de memória na célula. O raciocínio é o mesmo em eletrônica, como no circuito flip-flop do tipo set-reset, que é capaz de servir como uma memória de um bit em circuitos digitais.
O sistema pode ser interpretado através da tabela verdade de NOR: As entradas são as interações (de repressão ou ativação) do sinal exógeno e do produto gênico, enquanto os números 0 e 1 associados à falso e verdadeiro, podem ser interpretados respectivamente como repressão e ativação nas colunas da entrada, e existência (um) ou não (zero) de
um output na coluna da saída. Então por exemplo, tendo A como o calor (heat) e B como a proteína repressora Cl (produzida por cl-ts) só se terá uma saída (o número 1), ou melhor, um estado estável do toggle (em que é expresso apenas um conjunto de genes), se houver uma interação entre repressões, ou seja, a repressão do repressor, no caso o calor reprimindo a repressão de Cl de lacl, que produz um estado estável de produção de Ptrc2 e GFP (green flourescent protein). Para o outro estado estável, com produção de Cl e repressão do gene lacl, a idéia é a mesma, basta fazer A igual à IPTG e B igual à Ptrc2.
AND (conhecido também por E):
Imagem retirada e modificada da referência (Khalil, A., & Collins, J.).
Nesse exemplo, são necessários dois inputs para se obter o output: um de arabinose para transcrever a polimerase T7 com dois stop codons âmbar (é uma classe de stop codons, representada no desenho como pequeninos círculos vermelhos com pontas) no código do seu gene (a polimerase é necessária para expressar o sinal de GFP); e outro sinal de salicilato que promove a transcrição de supD, um RNA transportador supressor de stop codons âmbar. Desse modo, tomando A da tabela verdade como a arabinose, e B como salicilato, pode-se ver claramente que apenas com a ativação da transcrição feita por esses fatores a expressão desses dois genes, pode ocorrer o output de luz fluorescente verde dada pela GFP: o produto de supD suprime os stop codons do gene t7pol, permitindo a transcrição completa de polimerase T7.
Esse é um exemplo de quão sofisticado um sistema gênico pode ser ao se ligar a informação sensorial de múltiplos elementos sensitivos a uma expressão gênica programada. O interessante dessa interface entre engenharia elétrica e microbiologia é a possibilidade de construção de sistemas gênicos com o mesmo princípio de uma série de outros dispositivos já existentes na engenharia, e também o contrário: (porque não!?) usar os dispositivos moleculares que a própria natureza criou e aplicá-los na eletrônica.
Para mais informações sobre outros sistemas bem interessantes, vale ver o review muito legal sobre biologia sintética:
Khalil, A., & Collins, J. (2010). Synthetic biology: applications come of age Nature Reviews Genetics, 11 (5), 367-379 DOI: 10.1038/nrg2775
Switch de Luz Vermelha
Os mecanismos de ativação da expressão gênica majoritariamente utilizados em biologia sintética hoje, que utilizam pulsos de algum tipo de metabólito para a indução de uma resposta gênica, possuem diversas desvantagens, indo desde uma cinética de ativação ineficiente a até possivelmente efeitos tóxicos dependendo do metabólito utilizado.
A indução de uma atividade gênica baseada em uma transmissão de
informação na velocidade de fóton é muito mais precisa, rápida e prática que qualquer outro metabólito que exista pelos simples fatos de que um fóton não precisa ser “dissolvido” no citosol, não precisa colidir com o seu alvo de alguma maneira particular para iniciar uma resposta enzimática, e talvez o mais importante: um fóton não causa efeitos pleiotrópicos (i.e. ativação de um gene não desejado) e não antecipados como um metabólito (Bem, isso se você tiver certeza de que não há mais nenhum receptor de luz além daquele que você vai usar na sua bactéria) Somado à isso, a luz é um indutor de resposta gênica barato, universalmente disponível, simples de usar, não-invasivo, atóxico, de alta inducibilidade e reversibilidade, e que pode ser facilmente utilizado em vários sistemas.
Provavelmente no futuro a grande maioria dos mecanismos indutores de máquinas geneticamente modificadas deverão ser induzidos por luz, ou quem sabe por quaisquer outros tipos de indutores de expressão com características equiparáveis.
Para se ter uma noção do funcionamento de um switch de luz, mais particularmente de luz vermelha, vamos dar uma olhada no mecanismo molecular por trás dessa idéia.
Mecanismo Molecular
O mecanismo molecular de ativação por luz provém, como era de se esperar, de proteínas vegetais encontradas no cloroplasto. Elas estão envolvidas no fotoperiodismo das plantas, germinação de sementes, e síntese de clorofila, além de outras coisas. Essas proteínas são os fitocromos.
Os fitocromos não possuem atividade sensível à luz por si só: é
necessário estar covalentemente ligado à um cromóforo, que nas plantas é a fitocromobilina (PφB), e em cianobactérias é a ficocianobilina (PCB), que é o mais usado devido à sua fácil purificação. Na ausência desses cromóforos não há mudanças conformacionais devido à luz nos fitocromos, é ele que capta a energia do fóton e traduz em uma mudança conformacional na proteína, culminando na mudança de sua funcionalidade.
O funcionamento deste biossensor sintético se dá através da construção de proteínas quiméricas a partir de receptores de luz e fatores de transcrição. Para receptores de luz vermelha (660 nm) há pelo menos dois tipos de mecanismos celulares construídos, que são os que vamos falar aqui, ambos utilizando uma idéia muito interessante: a fusão de partes de proteínas, as chamadas proteínas quimeras. Essa fusão vai além do aspecto estrutural e junta características funcionais de cada parte em uma proteína só. Não é demais!?
Um desses mecanismos, utilizando um híbrido entre fitocromo
(podendo ser A ou B) e o domínio quinase da proteína de E.Coli EnvZ. Essa quimera possui um mecanismo de inibição através da exposição à luz vermelha: quando o domínio quinase está fosforilado, há a expressão gênica (no caso, de lacZ, que induz a formação de um pigmento branco por ação da expressão de β-Galactosidase), já na presença de luz vermelha, o domínio torna-se desfosforilado e inibe a expressão (veja a imagem 1). Esse mecanismo molecular para a construção de um light switch foi o utilizado pelo time da universidade do Texas na competição de biologia sintética realizada no verão, no período de atividades independentes do MIT de 2004, o qual impulsionou a criação do iGEM.
O outro mecanismo molecular atua através de duas quimeras: uma
resultante da fusão entre o fitocromo (A ou B) e o domínio de ligação ao DNA (GBD) da proteína GAL4, e a outra um híbrido de PIF3 (phytochrome interaction factor 3) e o domínio de ativação de transcrição (GAD), também do fator de transcrição GAL4. Quando não exposto à luz ou exposto à luz infra-vermelha (far-red light, FR), o fitocromo na conformação Pr (forma inativa) somente fica ligado ao DNA através do domínio do domínio GBD, porém quando exposto à luz vermelha, a proteína quimérica do fitocromo ganha a conformação Pfr (forma ativa) que se liga à PIF3-GAD com alta afinidade, o que induz a transcrição do gene alvo (veja a imagem 2).
Outras proteínas podem ser usadas substituindo PIF3, como FHY1
(far-red elongated hypocotyl 1) ou FHL (FHY1 like), fundidas à GAD também (imagem 3).
O grande diferencial deste último mecanismo de switch é a rapidez
de resposta gênica e fácil modulação. A conversão das formas Pr para Pfr ocorrem em milissegundos, e a transcrição em segundos. A indução reversa é igualmente rápida, exigindo apenas uma dissociação entre a quimera com GBD e a com GAD. Isso permite alto sincronismo e uma indução da expressão uniformizada na população celular.
Agora imagine a aplicabilidade disso, por exemplo, em uma indústria que precise produzir um biomedicamento que necessite ser constituído de proporções de dois diferentes compostos. Ela teria que criar dois processos independentes de produção, dois biorreatores, uma unidade de mistura, teria que dosar as quantidades sendo misturadas e etc: iria ter que sustentar dois processos paralelos. Com um simples mecanismo molecular de light switch o
remédio ficaria muito mais barato e rápido de se produzir com apenas um apagar
e acender de lâmpadas. Os dois constituintes do medicamento poderiam ser produzidos no mesmo biorreator e em proporções que seguiriam apenas o tempo de exposição à determinada luz, no caso deste post, luz vermelha e infravermelha. Bacana não é? E isso é só um exemplo.
Para maiores e mais específicas informações, vale dar uma olhada
nos papers aqui embaixo (a referência 3 traz um modelo matemático bem legal ).
1) Levskaya A, Chevalier AA, Tabor JJ, Simpson ZB, Lavery LA, Levy M, Davidson EA, Scouras A, Ellington AD, Marcotte EM, & Voigt CA (2005). Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light. Nature, 438 (7067), 441-2 PMID: 16306980
2)Shimizu-Sato S, Huq U, Tepperman JM, Quail PH (2002). A light-switchtable gene promoter system Nature Biotechnology, 1041-1044 DOI:10.1038
3) Sorokina O, Kapus A, Terecskei K, Dixon LE, Kozma-Bognar L, Nagy F, & Millar AJ (2009). A switchable light-input, light-output system modelled and constructed in yeast. Journal of biological engineering, 3 PMID: 19761615