Como montar o seu próprio laboratório de garagem?

Aqui no SynBio Brasil já foi comentado sobre a onda cada vez mais crescente de pessoas desenvolvendo seus próprios experimentos de Biologia Sintética em suas garagens, o DIYBio. Mas quais são os equipamentos necessários (e mais baratos) para montar o seu próprio laboratório? A revista Nature publicou uma reportagem no ano passado sobre esse assunto e identificou os seguintes equipamentos que não podem faltar em um laboratório de SynBio de garagem:

Equipamentos b√°sicos:

1) Pipetas ($275 ‚Äď $630): Servem para a aplica√ß√£o de subst√Ęncias com volume controlado

2) Freezer -20¬ļC ($180 ‚Äď $500): Serve para refrigerar amostras, culturas, enzimas, etc.

3) Equipamento para corridas de gel ($115 – $190): Identificar e separar fragmentos de DNA ou RNA

4) Shaker ($50 – $400): Serve para misturar solu√ß√Ķes

5) Balança ($5 Р$3,000): Serve para medir massas

6) Chapa de aquecimento ($100 – $200): Serve para o aquecimento de
solu√ß√Ķes

Equipamentos que podem ser improvisados:

1) Autoclave ($250 – $2,000): Esteriliza solu√ß√Ķes e materiais

2) Microcentr√≠fuga ($60 – $850): Centrifuga solu√ß√Ķes

3) Incubador ($100 Р$800): Mantém amostras aquecidas

4) Termociclador ou M√°quina de PCR ($195 – $1,000): Faz ciclos de
amplificação de segmentos de DNA

Equipamentos que exigem um investimento alto:

1) Exaustor ($500 ‚Äď $7,000): Mant√©m a bancada est√©ril e livre de
gases tóxicos

2) HPLC ($2,000 – $54,000): Qualifica e quantifica subst√Ęncias de
uma amostra

3) Espectr√īmetro UV/VIS ($180 – $3,000): Quantifica e define a pureza em que uma subst√Ęncia est√° em uma amostra

Além disso, eu incluiria um pHmetro ($30 Р$800), pois é muito importante para a confecção de alguns meios de cultura manter as
condi√ß√Ķes de pH adequadas ao organismo que ser√° cultivado; al√©m de um microsc√≥pio, √ļtil para identificar coisas b√°sicas como o tipo celular que est√° crescendo em sua cultura, com base na forma ou colora√ß√Ķes de Gram.

Para alguns, o pre√ßo de certos equipamentos pode parecer um empecilho muito grande no desenvolvimento de um laborat√≥rio de garagem, mas a revista mostra exemplos de ‚ÄúBiohakers‚ÄĚ que buscaram financiamento para suas pesquisas atrav√©s de sites solicitando doa√ß√Ķes com base em seus projetos como o Kickstarter. Outra op√ß√£o √© se unir aos ‚ÄúEngenheiros de Garagem‚ÄĚ e montar seus pr√≥prios equipamentos! Segundo a revista, √© poss√≠vel fazer um microsc√≥pio de $10 adaptando-se a lentes de uma webcam, ou at√© mesmo dispensar um incubador e aquecer amostras nas pr√≥prias axilas (eu mesmo j√° cheguei a aquecer amostras congeladas de Taq polimerase com as pr√≥prias m√£os!!!). No Brasil, um bom come√ßo para esse tipo de parceria √© a rede social Laborat√≥rio de Garagem em que pessoas trocam informa√ß√Ķes sobre diversas formas de se construir equipamentos com baixo custo.

Com todas essas informa√ß√Ķes, n√£o h√° desculpas para os Bi√≥logos de Plant√£o come√ßarem a botar a m√£o na massa!!!

Portas Lógicas em Sistemas Gênicos

ResearchBlogging.org

A associa√ß√£o da biologia sint√©tica com a eletr√īnica √© bem grande. A semelhan√ßa entre a intera√ß√£o de enzimas, fatores de transcri√ß√£o e DNA, e circuitos el√©tricos gera uma interessante conex√£o interdisciplinar entre engenharia el√©trica e biologia, tanto que os pr√≥prios fundadores do iGEM e do registry of parts s√£o engenheiros el√©tricos!

Algumas boas analogias, ou melhor, interpreta√ß√Ķes dos sistemas g√™nicos, s√£o feitas com o uso de portas l√≥gicas para classificar o comportamento das intera√ß√Ķes g√™nicas. Portas l√≥gicas baseiam-se na l√≥gica booleana, usada largamente em computa√ß√£o. Para entender melhor, vamos ver uns dois exemplos: o NOR e AND.

NOR¬†(“not OR”, o inverso do resultado para a porta OR, conhecido tamb√©m como NEM):

Imagem retirada e modificada da referência (Khalil, A., & Collins, J.).
 

Como j√° foi mostrado aqui no blog, esse dispositivo possui dois estados est√°veis que podem ser ligados ou desligados atrav√©s de inputs espec√≠ficos. Retirando esse input, no caso sinais ex√≥genos como calor e IPTG, o sistema preserva o seu estado, criando assim uma forma molecular n√£o exclusivamente estrutural (i.e. conforma√ß√£o de prote√≠nas e etc) de mem√≥ria na c√©lula. O racioc√≠nio √© o mesmo em eletr√īnica, como no circuito flip-flop¬†do tipo set-reset, que √© capaz de servir como uma mem√≥ria de um bit em circuitos digitais.

O sistema pode ser interpretado atrav√©s da tabela verdade de NOR: As entradas s√£o as intera√ß√Ķes (de repress√£o ou ativa√ß√£o) do sinal ex√≥geno e do produto g√™nico, enquanto os n√ļmeros 0 e 1 associados √† falso e verdadeiro, podem ser interpretados respectivamente como repress√£o e ativa√ß√£o nas colunas da entrada, e exist√™ncia (um) ou n√£o (zero) de
um output na coluna da sa√≠da. Ent√£o por exemplo, tendo A como o calor (heat) e B como a prote√≠na repressora Cl (produzida por cl-ts) s√≥ se ter√° uma sa√≠da (o n√ļmero 1), ou melhor, um estado est√°vel do toggle (em que √© expresso apenas um conjunto de genes), se houver uma intera√ß√£o entre repress√Ķes, ou seja, a repress√£o do repressor, no caso o calor reprimindo a repress√£o de Cl de lacl, que produz um estado est√°vel de produ√ß√£o de Ptrc2 e GFP (green flourescent protein). Para o outro estado est√°vel, com produ√ß√£o de Cl e repress√£o do gene lacl, a id√©ia √© a mesma, basta fazer A igual √† IPTG e B igual √† Ptrc2.

AND (conhecido também por E):

Imagem retirada e modificada da referência (Khalil, A., & Collins, J.).
 

Nesse exemplo, s√£o necess√°rios dois inputs para se obter o output: um de arabinose para transcrever a polimerase T7 com dois stop codons √Ęmbar (√© uma classe de stop codons, representada no desenho como pequeninos c√≠rculos vermelhos com pontas) no c√≥digo do seu gene (a polimerase √© necess√°ria para expressar o sinal de GFP); e outro sinal de salicilato que promove a transcri√ß√£o de supD, um RNA transportador supressor de stop codons √Ęmbar. Desse modo, tomando A da tabela verdade como a arabinose, e B como salicilato, pode-se ver claramente que apenas com a ativa√ß√£o da transcri√ß√£o feita por esses fatores a express√£o desses dois genes, pode ocorrer o output de luz fluorescente verde dada pela GFP: o produto de supD suprime os stop codons do gene t7pol, permitindo a transcri√ß√£o completa de polimerase T7.

Esse √© um exemplo de qu√£o sofisticado um sistema g√™nico pode ser ao se ligar a informa√ß√£o sensorial de m√ļltiplos elementos sensitivos a uma express√£o g√™nica programada. O interessante dessa interface entre engenharia el√©trica e microbiologia √© a possibilidade de constru√ß√£o de sistemas g√™nicos com o mesmo princ√≠pio de uma s√©rie de outros dispositivos j√° existentes na engenharia, e tamb√©m o contr√°rio: (porque n√£o!?) usar os dispositivos moleculares que a pr√≥pria natureza criou e aplic√°-los na eletr√īnica.

Para mais informa√ß√Ķes sobre outros sistemas bem interessantes, vale ver o review muito legal sobre biologia sint√©tica:

Khalil, A., & Collins, J. (2010). Synthetic biology: applications come of age Nature Reviews Genetics, 11 (5), 367-379 DOI: 10.1038/nrg2775

Switch de Luz Vermelha

ResearchBlogging.org

Os mecanismos de ativação da expressão gênica majoritariamente utilizados em biologia sintética hoje, que utilizam pulsos de algum tipo de metabólito para a indução de uma resposta gênica, possuem diversas desvantagens, indo desde uma cinética de ativação ineficiente a até possivelmente efeitos tóxicos dependendo do metabólito utilizado.

A indução de uma atividade gênica baseada em uma transmissão de
informa√ß√£o na velocidade de f√≥ton √© muito mais precisa, r√°pida e pr√°tica que qualquer outro metab√≥lito que exista pelos simples fatos de que um f√≥ton n√£o precisa ser “dissolvido” no citosol, n√£o precisa colidir com o seu alvo de alguma maneira particular para iniciar uma resposta enzim√°tica, e talvez o mais importante: um f√≥ton n√£o causa efeitos pleiotr√≥picos (i.e. ativa√ß√£o de um gene n√£o desejado) e n√£o antecipados como um metab√≥lito (Bem, isso se voc√™ tiver certeza de que n√£o h√° mais nenhum receptor de luz al√©m daquele que voc√™ vai usar na sua bact√©ria) Somado √† isso, a luz √© um indutor de resposta g√™nica barato, universalmente dispon√≠vel, simples de usar, n√£o-invasivo, at√≥xico, de alta inducibilidade e reversibilidade, e que pode ser facilmente utilizado em v√°rios sistemas.

Provavelmente no futuro a grande maioria dos mecanismos indutores de máquinas geneticamente modificadas deverão ser induzidos por luz, ou quem sabe por quaisquer outros tipos de indutores de expressão com características equiparáveis.

Para se ter uma noção do funcionamento de um switch de luz, mais particularmente de luz vermelha, vamos dar uma olhada no mecanismo molecular por trás dessa idéia.

Mecanismo Molecular

O mecanismo molecular de ativação por luz provém, como era de se esperar, de proteínas vegetais encontradas no cloroplasto. Elas estão envolvidas no fotoperiodismo das plantas, germinação de sementes, e síntese de clorofila, além de outras coisas. Essas proteínas são os fitocromos.

Os fitocromos não possuem atividade sensível à luz por si só: é
necess√°rio estar covalentemente ligado √† um crom√≥foro, que nas plantas √© a fitocromobilina (PŌÜB), e em cianobact√©rias √© a ficocianobilina (PCB), que √© o mais usado devido √† sua f√°cil purifica√ß√£o. Na aus√™ncia desses crom√≥foros n√£o h√° mudan√ßas conformacionais devido √† luz nos fitocromos, √© ele que capta a energia do f√≥ton e traduz em uma mudan√ßa conformacional na prote√≠na, culminando na mudan√ßa de sua funcionalidade.

O funcionamento deste biossensor sintético se dá através da construção de proteínas quiméricas a partir de receptores de luz e fatores de transcrição. Para receptores de luz vermelha (660 nm) há pelo menos dois tipos de mecanismos celulares construídos, que são os que vamos falar aqui, ambos utilizando uma idéia muito interessante: a fusão de partes de proteínas, as chamadas proteínas quimeras. Essa fusão vai além do aspecto estrutural e junta características funcionais de cada parte em uma proteína só. Não é demais!?

Um desses mecanismos, utilizando um híbrido entre fitocromo
(podendo ser A ou B) e o dom√≠nio quinase da prote√≠na de E.Coli EnvZ. Essa quimera possui um mecanismo de inibi√ß√£o atrav√©s da exposi√ß√£o √† luz vermelha: quando o dom√≠nio quinase est√° fosforilado, h√° a express√£o g√™nica (no caso, de lacZ, que induz a forma√ß√£o de um pigmento branco por a√ß√£o da express√£o de ő≤-Galactosidase), j√° na presen√ßa de luz vermelha, o dom√≠nio torna-se desfosforilado e inibe a express√£o (veja a imagem 1). Esse mecanismo molecular para a constru√ß√£o de um light switch foi o utilizado pelo time da universidade do Texas na competi√ß√£o de biologia sint√©tica realizada no ver√£o, no per√≠odo de atividades independentes do MIT de 2004, o qual impulsionou a cria√ß√£o do iGEM.

O outro mecanismo molecular atua através de duas quimeras: uma
resultante da fusão entre o fitocromo (A ou B) e o domínio de ligação ao DNA (GBD) da proteína GAL4, e a outra um híbrido de PIF3 (phytochrome interaction factor 3) e o domínio de ativação de transcrição (GAD), também do fator de transcrição GAL4. Quando não exposto à luz ou exposto à luz infra-vermelha (far-red light, FR), o fitocromo na conformação Pr (forma inativa) somente fica ligado ao DNA através do domínio do domínio GBD, porém quando exposto à luz vermelha, a proteína quimérica do fitocromo ganha a conformação Pfr (forma ativa) que se liga à PIF3-GAD com alta afinidade, o que induz a transcrição do gene alvo (veja a imagem 2).

Outras proteínas podem ser usadas substituindo PIF3, como FHY1
(far-red elongated hypocotyl 1) ou FHL (FHY1 like), fundidas à GAD também (imagem 3).

O grande diferencial deste √ļltimo mecanismo de switch √© a rapidez
de resposta gênica e fácil modulação. A conversão das formas Pr para Pfr ocorrem em milissegundos, e a transcrição em segundos. A indução reversa é igualmente rápida, exigindo apenas uma dissociação entre a quimera com GBD e a com GAD. Isso permite alto sincronismo e uma indução da expressão uniformizada na população celular.

Agora imagine a aplicabilidade disso, por exemplo, em uma ind√ļstria que precise produzir um biomedicamento que necessite ser constitu√≠do de propor√ß√Ķes de dois diferentes compostos. Ela teria que criar dois processos independentes de produ√ß√£o, dois biorreatores, uma unidade de mistura, teria que dosar as quantidades sendo misturadas e etc: iria ter que sustentar dois processos paralelos. Com um simples mecanismo molecular de light switch o
remédio ficaria muito mais barato e rápido de se produzir com apenas um apagar
e acender de l√Ęmpadas. Os dois constituintes do medicamento poderiam ser produzidos no mesmo biorreator e em propor√ß√Ķes que seguiriam apenas o tempo de exposi√ß√£o √† determinada luz, no caso deste post, luz vermelha e infravermelha. Bacana n√£o √©? E isso √© s√≥ um exemplo.

Para maiores e mais espec√≠ficas informa√ß√Ķes, vale dar uma olhada
nos papers aqui embaixo (a referência 3 traz um modelo matemático bem legal ).

1) Levskaya A, Chevalier AA, Tabor JJ, Simpson ZB, Lavery LA, Levy M, Davidson EA, Scouras A, Ellington AD, Marcotte EM, & Voigt CA (2005). Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light. Nature, 438 (7067), 441-2 PMID: 16306980

2)Shimizu-Sato S, Huq U, Tepperman JM, Quail PH (2002). A light-switchtable gene promoter system Nature Biotechnology, 1041-1044 DOI:10.1038

3) Sorokina O, Kapus A, Terecskei K, Dixon LE, Kozma-Bognar L, Nagy F, & Millar AJ (2009). A switchable light-input, light-output system modelled and constructed in yeast. Journal of biological engineering, 3 PMID: 19761615