Como montar o seu pr贸prio laborat贸rio de garagem?

Aqui no SynBio Brasil j谩 foi comentado sobre a onda cada vez mais crescente de pessoas desenvolvendo seus pr贸prios experimentos de Biologia Sint茅tica em suas garagens, o DIYBio. Mas quais s茫o os equipamentos necess谩rios (e mais baratos) para montar o seu pr贸prio laborat贸rio? A revista Nature聽publicou uma reportagem no ano passado sobre esse assunto e identificou os seguintes equipamentos que n茫o podem faltar em um laborat贸rio de SynBio de garagem:

Equipamentos b谩sicos:

1) Pipetas ($275 鈥 $630): Servem para a aplica莽茫o de subst芒ncias com volume controlado

2) Freezer -20潞C ($180 鈥 $500): Serve para refrigerar amostras, culturas, enzimas, etc.

3) Equipamento para corridas de gel ($115 – $190): Identificar e separar fragmentos de DNA ou RNA

4) Shaker ($50 – $400): Serve para misturar solu莽玫es

5) Balan莽a ($5 – $3,000): Serve para medir massas

6) Chapa de aquecimento ($100 – $200): Serve para o aquecimento de
solu莽玫es

Equipamentos que podem ser improvisados:

1) Autoclave ($250 – $2,000): Esteriliza solu莽玫es e materiais

2) Microcentr铆fuga ($60 – $850): Centrifuga solu莽玫es

3) Incubador ($100 – $800): Mant茅m amostras aquecidas

4) Termociclador ou M谩quina de PCR ($195 – $1,000): Faz ciclos de
amplifica莽茫o de segmentos de DNA

Equipamentos que exigem um investimento alto:

1) Exaustor ($500 鈥 $7,000): Mant茅m a bancada est茅ril e livre de
gases t贸xicos

2) HPLC ($2,000 – $54,000): Qualifica e quantifica subst芒ncias de
uma amostra

3) Espectr么metro UV/VIS ($180 – $3,000): Quantifica e define a pureza em que uma subst芒ncia est谩 em uma amostra

Al茅m disso, eu incluiria um pHmetro ($30 – $800), pois 茅 muito importante para a confec莽茫o de alguns meios de cultura manter as
condi莽玫es de pH adequadas ao organismo que ser谩 cultivado; al茅m de um microsc贸pio, 煤til para identificar coisas b谩sicas como o tipo celular que est谩 crescendo em sua cultura, com base na forma ou colora莽玫es de Gram.

Para alguns, o pre莽o de certos equipamentos pode parecer um empecilho muito grande no desenvolvimento de um laborat贸rio de garagem, mas a revista mostra exemplos de 鈥Biohakers鈥 que buscaram financiamento para suas pesquisas atrav茅s de sites solicitando doa莽玫es com base em seus projetos como o Kickstarter. Outra op莽茫o 茅 se unir aos 鈥Engenheiros de Garagem鈥 e montar seus pr贸prios equipamentos! Segundo a revista, 茅 poss铆vel fazer um microsc贸pio de $10 adaptando-se a lentes de uma webcam, ou at茅 mesmo dispensar um incubador e aquecer amostras nas pr贸prias axilas (eu mesmo j谩 cheguei a aquecer amostras congeladas de Taq polimerase com as pr贸prias m茫os!!!). No Brasil, um bom come莽o para esse tipo de parceria 茅 a rede social Laborat贸rio de Garagem em que pessoas trocam informa莽玫es sobre diversas formas de se construir equipamentos com baixo custo.

Com todas essas informa莽玫es, n茫o h谩 desculpas para os Bi贸logos de Plant茫o come莽arem a botar a m茫o na massa!!!

Portas L贸gicas em Sistemas G锚nicos

ResearchBlogging.org

A associa莽茫o da biologia sint茅tica com a eletr么nica 茅 bem grande. A semelhan莽a entre a intera莽茫o de enzimas, fatores de transcri莽茫o e DNA, e circuitos el茅tricos gera uma interessante conex茫o interdisciplinar entre engenharia el茅trica e biologia, tanto que os pr贸prios fundadores do iGEM e do registry of parts s茫o engenheiros el茅tricos!

Algumas boas analogias, ou melhor, interpreta莽玫es dos sistemas g锚nicos, s茫o feitas com o uso de portas l贸gicas para classificar o comportamento das intera莽玫es g锚nicas. Portas l贸gicas baseiam-se na l贸gica booleana, usada largamente em computa莽茫o. Para entender melhor, vamos ver uns dois exemplos: o NOR e AND.

NOR聽(“not OR”, o inverso do resultado para a porta OR, conhecido tamb茅m como NEM):

Imagem retirada e modificada da refer锚ncia (Khalil, A., & Collins, J.).

Como j谩 foi mostrado aqui no blog, esse dispositivo possui dois estados est谩veis que podem ser ligados ou desligados atrav茅s de inputs espec铆ficos. Retirando esse input, no caso sinais ex贸genos como calor e IPTG, o sistema preserva o seu estado, criando assim uma forma molecular n茫o exclusivamente estrutural (i.e. conforma莽茫o de prote铆nas e etc) de mem贸ria na c茅lula. O racioc铆nio 茅 o mesmo em eletr么nica, como no circuito flip-flop聽do tipo set-reset, que 茅 capaz de servir como uma mem贸ria de um bit em circuitos digitais.

O sistema pode ser interpretado atrav茅s da tabela verdade de NOR: As entradas s茫o as intera莽玫es (de repress茫o ou ativa莽茫o) do sinal ex贸geno e do produto g锚nico, enquanto os n煤meros 0 e 1 associados 脿 falso e verdadeiro, podem ser interpretados respectivamente como repress茫o e ativa莽茫o nas colunas da entrada, e exist锚ncia (um) ou n茫o (zero) de
um output na coluna da sa铆da. Ent茫o por exemplo, tendo A como o calor (heat) e B como a prote铆na repressora Cl (produzida por cl-ts) s贸 se ter谩 uma sa铆da (o n煤mero 1), ou melhor, um estado est谩vel do toggle (em que 茅 expresso apenas um conjunto de genes), se houver uma intera莽茫o entre repress玫es, ou seja, a repress茫o do repressor, no caso o calor reprimindo a repress茫o de Cl de lacl, que produz um estado est谩vel de produ莽茫o de Ptrc2 e GFP (green flourescent protein). Para o outro estado est谩vel, com produ莽茫o de Cl e repress茫o do gene lacl, a id茅ia 茅 a mesma, basta fazer A igual 脿 IPTG e B igual 脿 Ptrc2.

AND聽(conhecido tamb茅m por E):

Imagem retirada e modificada da refer锚ncia (Khalil, A., & Collins, J.).

Nesse exemplo, s茫o necess谩rios dois inputs para se obter o output: um de arabinose para transcrever a polimerase T7 com dois stop codons 芒mbar (茅 uma classe de stop codons, representada no desenho como pequeninos c铆rculos vermelhos com pontas) no c贸digo do seu gene (a polimerase 茅 necess谩ria para expressar o sinal de GFP); e outro sinal de salicilato que promove a transcri莽茫o de supD, um RNA transportador supressor de stop codons 芒mbar. Desse modo, tomando A da tabela verdade como a arabinose, e B como salicilato, pode-se ver claramente que apenas com a ativa莽茫o da transcri莽茫o feita por esses fatores a express茫o desses dois genes, pode ocorrer o output de luz fluorescente verde dada pela GFP: o produto de supD suprime os stop codons do gene t7pol, permitindo a transcri莽茫o completa de polimerase T7.

Esse 茅 um exemplo de qu茫o sofisticado um sistema g锚nico pode ser ao se ligar a informa莽茫o sensorial de m煤ltiplos elementos sensitivos a uma express茫o g锚nica programada. O interessante dessa interface entre engenharia el茅trica e microbiologia 茅 a possibilidade de constru莽茫o de sistemas g锚nicos com o mesmo princ铆pio de uma s茅rie de outros dispositivos j谩 existentes na engenharia, e tamb茅m o contr谩rio: (porque n茫o!?) usar os dispositivos moleculares que a pr贸pria natureza criou e aplic谩-los na eletr么nica.

Para mais informa莽玫es sobre outros sistemas bem interessantes, vale ver o review muito legal sobre biologia sint茅tica:

Khalil, A., & Collins, J. (2010). Synthetic biology: applications come of age Nature Reviews Genetics, 11 (5), 367-379 DOI: 10.1038/nrg2775

Switch de Luz Vermelha

ResearchBlogging.org

Os mecanismos de ativa莽茫o da express茫o g锚nica majoritariamente utilizados em biologia sint茅tica hoje, que utilizam pulsos de algum tipo de metab贸lito para a indu莽茫o de uma resposta g锚nica, possuem diversas desvantagens, indo desde uma cin茅tica de ativa莽茫o ineficiente a at茅 possivelmente efeitos t贸xicos dependendo do metab贸lito utilizado.

A indu莽茫o de uma atividade g锚nica baseada em uma transmiss茫o de
informa莽茫o na velocidade de f贸ton 茅 muito mais precisa, r谩pida e pr谩tica que qualquer outro metab贸lito que exista pelos simples fatos de que um f贸ton n茫o precisa ser “dissolvido” no citosol, n茫o precisa colidir com o seu alvo de alguma maneira particular para iniciar uma resposta enzim谩tica, e talvez o mais importante: um f贸ton n茫o causa efeitos pleiotr贸picos (i.e. ativa莽茫o de um gene n茫o desejado) e n茫o antecipados como um metab贸lito (Bem, isso se voc锚 tiver certeza de que n茫o h谩 mais nenhum receptor de luz al茅m daquele que voc锚 vai usar na sua bact茅ria) Somado 脿 isso, a luz 茅 um indutor de resposta g锚nica barato, universalmente dispon铆vel, simples de usar, n茫o-invasivo, at贸xico, de alta inducibilidade e reversibilidade, e que pode ser facilmente utilizado em v谩rios sistemas.

Provavelmente no futuro a grande maioria dos mecanismos indutores de m谩quinas geneticamente modificadas dever茫o ser induzidos por luz, ou quem sabe por quaisquer outros tipos de indutores de express茫o com caracter铆sticas equipar谩veis.

Para se ter uma no莽茫o do funcionamento de um switch de luz, mais particularmente de luz vermelha, vamos dar uma olhada no mecanismo molecular por tr谩s dessa id茅ia.

Mecanismo Molecular

O mecanismo molecular de ativa莽茫o por luz prov茅m, como era de se聽esperar, de prote铆nas vegetais encontradas no cloroplasto. Elas est茫o envolvidas no fotoperiodismo das plantas, germina莽茫o de sementes, e s铆ntese de clorofila, al茅m de outras coisas. Essas prote铆nas s茫o os fitocromos.

Os fitocromos n茫o possuem atividade sens铆vel 脿 luz por si s贸: 茅
necess谩rio estar covalentemente ligado 脿 um crom贸foro, que nas plantas 茅 a fitocromobilina (P蠁B), e em cianobact茅rias 茅 a ficocianobilina (PCB), que 茅 o mais usado devido 脿 sua f谩cil purifica莽茫o. Na aus锚ncia desses crom贸foros n茫o h谩 mudan莽as conformacionais devido 脿 luz nos fitocromos, 茅 ele que capta a energia do f贸ton e traduz em uma mudan莽a conformacional na prote铆na, culminando na mudan莽a de sua funcionalidade.

O funcionamento deste biossensor sint茅tico se d谩 atrav茅s da constru莽茫o de prote铆nas quim茅ricas a partir de receptores de luz e fatores de transcri莽茫o. Para receptores de luz vermelha (660 nm) h谩 pelo menos dois tipos de mecanismos celulares constru铆dos, que s茫o os que vamos falar aqui, ambos utilizando uma id茅ia muito interessante: a fus茫o de partes de prote铆nas, as chamadas prote铆nas quimeras. Essa fus茫o vai al茅m do aspecto estrutural e junta caracter铆sticas funcionais de cada parte em uma prote铆na s贸. N茫o 茅 demais!?

Um desses mecanismos, utilizando um h铆brido entre fitocromo
(podendo ser A ou B) e o dom铆nio quinase da prote铆na de E.Coli EnvZ. Essa quimera possui um mecanismo de inibi莽茫o atrav茅s da exposi莽茫o 脿 luz vermelha: quando o dom铆nio quinase est谩 fosforilado, h谩 a express茫o g锚nica (no caso, de lacZ, que induz a forma莽茫o de um pigmento branco por a莽茫o da express茫o de 尾-Galactosidase), j谩 na presen莽a de luz vermelha, o dom铆nio torna-se desfosforilado e inibe a express茫o (veja a imagem 1). Esse mecanismo molecular para a constru莽茫o de um light switch foi o utilizado pelo time da universidade do Texas na competi莽茫o de biologia sint茅tica realizada no ver茫o, no per铆odo de atividades independentes do MIT de 2004, o qual impulsionou a cria莽茫o do iGEM.

O outro mecanismo molecular atua atrav茅s de duas quimeras: uma
resultante da fus茫o entre o fitocromo (A ou B) e o dom铆nio de liga莽茫o ao DNA (GBD) da prote铆na GAL4, e a outra um h铆brido de PIF3 (phytochrome interaction factor 3) e o dom铆nio de ativa莽茫o de transcri莽茫o (GAD), tamb茅m do fator de transcri莽茫o GAL4. Quando n茫o exposto 脿 luz ou exposto 脿 luz infra-vermelha (far-red light, FR), o fitocromo na conforma莽茫o Pr (forma inativa) somente fica ligado ao DNA atrav茅s do dom铆nio do dom铆nio GBD, por茅m quando exposto 脿 luz vermelha, a prote铆na quim茅rica do fitocromo ganha a conforma莽茫o Pfr (forma ativa) que se liga 脿 PIF3-GAD com alta afinidade, o que induz a transcri莽茫o do gene alvo (veja a imagem 2).

Outras prote铆nas podem ser usadas substituindo PIF3, como FHY1
(far-red elongated hypocotyl 1) ou FHL (FHY1 like), fundidas 脿 GAD tamb茅m (imagem 3).

O grande diferencial deste 煤ltimo mecanismo de switch 茅 a rapidez
de resposta g锚nica e f谩cil modula莽茫o. A convers茫o das formas Pr para Pfr ocorrem em milissegundos, e a transcri莽茫o em segundos. A indu莽茫o reversa 茅 igualmente r谩pida, exigindo apenas uma dissocia莽茫o entre a quimera com GBD e a com GAD. Isso permite alto sincronismo e uma indu莽茫o da express茫o uniformizada na popula莽茫o celular.

Agora imagine a aplicabilidade disso, por exemplo, em uma ind煤stria que precise produzir um biomedicamento que necessite ser constitu铆do de propor莽玫es de dois diferentes compostos. Ela teria que criar dois processos independentes de produ莽茫o, dois biorreatores, uma unidade de mistura, teria que dosar as quantidades sendo misturadas e etc: iria ter que sustentar dois processos paralelos. Com um simples mecanismo molecular de light switch o
rem茅dio ficaria muito mais barato e r谩pido de se produzir com apenas um apagar
e acender de l芒mpadas. Os dois constituintes do medicamento poderiam ser produzidos no mesmo biorreator e em propor莽玫es que seguiriam apenas o tempo de exposi莽茫o 脿 determinada luz, no caso deste post, luz vermelha e infravermelha. Bacana n茫o 茅? E isso 茅 s贸 um exemplo.

Para maiores e mais espec铆ficas informa莽玫es, vale dar uma olhada
nos papers aqui embaixo (a refer锚ncia 3 traz um modelo matem谩tico bem legal ).

1) Levskaya A, Chevalier AA, Tabor JJ, Simpson ZB, Lavery LA, Levy M, Davidson EA, Scouras A, Ellington AD, Marcotte EM, & Voigt CA (2005). Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light. Nature, 438 (7067), 441-2 PMID: 16306980

2)Shimizu-Sato S, Huq U, Tepperman JM, Quail PH (2002). A light-switchtable gene promoter system Nature Biotechnology, 1041-1044 DOI:10.1038

3) Sorokina O, Kapus A, Terecskei K, Dixon LE, Kozma-Bognar L, Nagy F, & Millar AJ (2009). A switchable light-input, light-output system modelled and constructed in yeast. Journal of biological engineering, 3 PMID: 19761615