Regeneração de colunas Miniprep Qiagen

Eu sempre achei um desperdício enorme jogar fora  as colunas presentes nos kits comerciais. Até que no ano passado, baseado em um protocolo simples e barato de Siddappa NP, publicado em 2007 na revista Biotechniques começamos a regenerar as colunas de extração de plasmídeo Miniprep Qiagen. Basicamente, as colunas são tratadas com 1 M de HCl durante a noite, lavadas repetidamente com água e reequilibradas com tampão EB ou TE.

Os autores do artigo estavam preocupados com a contaminação de DNA antigo nas colunas regeneradas e utilizaram RT-PCR e ensaios de transfecção para demonstrar que existe zero de contaminação nas colunas reutilizadas. Eles também demonstraram que a exposição prolongada a 1M de HCl não afeta a capacidade de ligação de DNA. Talvez seja apenas o prazer de usar uma coluna reutilizada, mas eu tenho a impressão que as colunas regeneradas funcionam melhor que as novas. Li em algum lugar que este protocolo funciona muito também para os Midi e MaxiPrep também.

O kit da Miniprep Qiagen com 50 reações custa cerca de R$350,00, dessa maneira, cada extração de plasmídeo custa cerca de 7 reais (contando apenas o custo de kit, sem contar eppendorfs, centrífuga, luz,…). Já utilizamos colunas regeneradas 5 vezes e queremos chegar até 10 regenerações, assim, poderemos realizar 50o extrações plasmidiais a cerca de R$o,35. Muito mais justo. O problema, agora, será a quantidade de buffers que você vai precisar. Mas não se preocupe, no final do artigo você vai encontrar os protocolos de tampões que podem ser utilizados no lugar dos comerciais (que acho que ainda podem ser otimizados).

Se alguém tiver outros protocolos para fazer render a verba, por favor, me avise!

Protocolo de regeneração das colunas de extração de DNA plasmidial:

1. Colocar em uma solução a 1N HCl por um dia (1 L para 100 colunas). Importante deixar as colunas imersas na solução sem bolhas dentro da coluna  (costumo sonicar por 5 min para retirar bolhas de ar);

2. Lavar repetidamente (4 – 5 vezes) as colunas com H2O destilada autoclavada.

3. Deixar secar a 37°C por 24h (acima desta temperatura as colunas estragam). Selar em plásticos e anotar no saco quantas vezes aquela coluna já foi utilizada. Manter em local seco.

4. Antes de utilizar, reequilibrar a coluna com 50 µL de TE a 42oC. Eu sempre faço a eluição do DNA a 42oC para aumentar o rendimento.

Soluções do kit Qiagen:

Buffer N3: 4.2 M Guanidina-HCl, 0.9 M potassium acetato,  pH 4.8

PS: já tentei o tampão de acetato de potássio do Birnborim (lise alcalina) mas não funcionou muito bem.

Buffer P1: 50mM Tris HCl pH, 10mM EDTA, 100µg/ml de RNase

Buffer P2: 200mM NaOH, 1% de SDS

Buffer PE: 10mM Tris HCl  pH 7,5, 80% etanol, 100 mM NaCl

PS: a concentração do sal me parece ser fundamental para uma boa eluição, eu tentei várias concentrações e com 100 mM obtive os melhores resultados.

Buffer EB (TE): 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0

Para mais detalhes, consulte o site do autor.

BioBricks: fabricação de pequenos fragmentos de DNA

Este protocolo é utilizado para a fabricação de BioBricks pequenos, como promotores ou sítios de ligação do ribossomo (RBS). Para isso, utiliza o anelamento e extensão dos primers para criar um pequeno fragmento de DNA (~ 100 bp) utilizando Taq polimerase de alta fidelidade. O fragmento de DNA pode ser imediatamente utilizado em uma reação de clonagem utilizando TOPO-TA. Caso se deseje realizar uma etapa de digestão do fragmento de DNA, uma etapa de purificação de produto de PCR é necessária.

Materiais:

– Dois primers que se sobrepõe por ~20 bp.

Primer 1:    5′ ———————————– 3′
Primer 2:                                        3′ ———————————– 5′

Mix para PCR Taq alta fidelidade

Método

1. Diluir os dois oligos a uma concentração de 25 μM utilizando H2O. Para primers maiores que 50-60 bp podem ocorrer problemas como erros e deleções, por isso, pode valer a pena incluir uma etapa de purificação extra PAGE (Invitrogen).

2. Misturar os reagentes em um tubo estéril de 0.6 mL:

  • 9 μL PCR supermix
  • 0.5 μL primer 1
  • 0.5 μL primer 2

3. A reação de anelamento e extensão dos primers ocorrem no termociclador segundo o seguinte protocolo:

  1. 94°C por 5 mins
  2. 94°C por 30 seconds
  3. 55°C por 30 seconds (ou qualquer outra temperatura de anelamento)
  4. 72°C por 30 seconds
  5. Repita os passos 2-4 por 2-3 ciclos
  6. 72°C por 5 mins

4. Utilize 1μL de produto de PCR fresco (feito no mesmo dia) numa reação de clonagem com TOPO TA cloning.

Para desenhar um BioBrick por esse método não se esqueça de colocar o prefixo e sufixo dos BioBricks nos primers. Pronto, já descrevemos os protocolos para desenhar e montar um circuito sintético com promotores, RBS e genes.

Boa sorte e qualquer dúvida, por favor, pergunte!

Referências

Stemmer WP, Crameri A, Ha KD, Brennan TM, and Heyneker HL. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene 1995 Oct 16; 164(1) 49-53. pmid:7590320. PubMed HubMed PubGet [Stemmer-Gene-1995].

http://openwetware.org/wiki/Knight:Annealing_and_primer_extension_with_Taq_polymerase

BioBricks: fabricação de uma parte padrão.

Até agora comentamos sobre a possibilidade de juntar diferentes componentes utilizando o padrão técnico de montagem dos BioBricks. Mas neste post vou comentar sobre a fabricação de uma parte padrão. No futuro, eu pretendo comentar sobre a síntese de DNA sintético, mas agora vou explicar como montar um BioBrick utilizando o método de PCR. O aparelho para realizar um PCR, o termociclador, está presente na maioria dos laboratórios de biologia molecular, e hoje se apresenta como uma ferramenta básica para este tipo de atividade. Existem centenas de livros e sites na Internet que podem te familiarizar com a técnica. Primeiramente, um BioBrick pode ser construído via PCR se existe algum molde de DNA do qual o BioBrick possa ser amplificado (por ex., um gene de alguma bactéria) ou se a parte é pequena o suficiente que possa ser criada através do alinhamento e extensão do primer (iniciador). Nos dois casos é necessário adicionar na extremidade 5′ dos primers as sequências referentes aos sítios das enzimas de restrição presentes nos BioBricks, os sufixos e prefixos (ver post anterior).

A construção de BioBricks contendo sequências codificadoras de proteínas requer um sufixo e um prefixo um pouco mais especializados por duas razões:

1. o prefixo é alterado para garantir o espaçamento entre o sítio de ligação do ribossomo e o códon ATG de início.

2. BioBricks que codificam proteínas possuem, por padronização, dois códons de sequência TAA de parada.

Ao construir os primers, basicamente, é necessário “copiar e colar” a seguinte sequência de 31 bp no fim 5′ no seu primer upstream (ou iniciador universal) desenhado para o seu fragmento de DNA de interesse:

5′ —> 3′
GTT TCT TCG AAT TCG CGG CCG CTT CTA G ATG…
start codon (no caso de um gene)
E “copiar e colar” os seguintes 35 bp no fim 5′ do seu primer downstream (iniciador reverso):

5′ —> 3′
GTT TCT TCC TGC AGC GGC CGC TAC TAG TA TTA TAA….
duplo stop codon!

A estas sequências deve-se somar aproximadamente 20 bp de sequência de primer relativa a região codificadora. Para este tipo de clonagem se utiliza uma Taq polimerase com alta fidelidade e um kit de clonagem TOPO-TA cloning.

Claro que todas as outras precauções para se desenhar um primer ainda são válidas, como a verificação de sítios de restrição nas sequências. Para mais detalhes, veja o protocolo disponibilizado para a fabricação de BioBricks.

BioBricks: juntando as peças

No post anterior comentei sobre os BioBricks, que são as partes padrão da biologia sintética adotada pelo iGEM e pelos pesquisadores envolvidos nessa comunidade. Nada mais são que fragmentos de DNA (codificadores para um gene, promotor, regulador…) que possuem extremidades iguais. Essas extremidades apresentam enzimas de restrição que facilitam a clonagem de outros fragmentos de DNA em paralelo (ver Figura), gerando componentes com as mesmas extremidades.

Prefixo                  Fragmento de DNA               Sufixo

Com  essa construção é possível inserir um fragmento de DNA anterior (na região chamada prefixo) ao seu inserto clonado ou posterior ao seu inserto clonado (na região chamada de sufixo). Para clonar um prefixo, por ex, o seu componente tem que ser digerido com EcoRI e XbaI e o prefixo digerido com EcoRI e SpeI. Ao ligarem-se os componentes (com uma enzima Ligase) ocorre a ligação dos sítios EcoRI e dos sítios XbaI e SpeI, que possuem extremidades compatíveis para a ligação, como mostrado na figura abaixo:

Este processo recria os sítios EcoRI e XbaI no começo do componente e cria um sítio não-digerível misturado de SpeI/XbaI no final da junção (entre os fragmentos de DNA). O componente continua a carregar os sítios SpeI e PstI no componente original na extremidade sufixo. Dessa maneira, é possível juntar dois BioBricks e um componente que mantêm o mesmo padrão de montagem.

Para mais detalhes consulte referência deste post escrita por Tom Knight, um dos idealizadores dos BioBricks: Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks.

BioBricks: as partes biológicas padrão da biologia sintética.

Um objetivo subjacente da biologia sintética é tornar o processo de engenharia de sistemas biológicos mais fácil. Dentro desse processo, tem-se procurado desenvolver e definir partes biológicas padrão, para garantir que as peças biológicas produzidas possam ser montadas com facilidade e trocadas entre os biólogos sintéticos pelo mundo de uma forma unificada e organizada. Assim, as partes biológicas padrão são sequências de ácidos nucléicos que codificam para uma função biológica que foram refinadas para se adequar a algum padrão técnico de montagem definido. Nesse sentido, um paralelo interessante pode ser feito com um circuito elétrico, em que os seus componentes (ex. diodo, resistência, interruptores, tomadas,…) precisam ter o mesmo tipo de conexão para poderem ser montados na sua casa, apesar de serem produzidos por fabricantes diferentes.

O padrão técnico de composição física de montagem de peças biológicas que tem ganhado mais adeptos na comunidade de biologia sintética são os BioBricks, ou Biotijolos em português, desenvolvido pelo MIT. A inovação principal dos BioBricks é a padronização do modo de montagem dessas partes padrão: de maneira que a montagem de dois BioBricks resulta em um objeto que também é um BioBrick e pode ser combinado com qualquer outro BioBrick (ver mais detalhes na Figura).

Utilizando apenas 2 pares de enzimas, pode-se montar diferentes componentes em paralelo (DNA assembly) gerando extremidades que ainda podem receber outros componentes. Dessa maneira, pode-se juntar genes, reguladores de transcrição e tradução, promotores e qualquer outra peça biológica, para formar novos circuitos biológicos.

Aulas de Introdução à Biologia Sintética do MIT

O MIT é pioneiro no campo da Biologia Sintética, foi a primeira universidade a criar o curso de Biological Engineering ou Bioengenharia, especializado em Synbio. Uma ótima notícia é que esta incrível universidade, através do MIT Opencourseware, disponibiliza gratuitamente cursos, palestras e aulas para qualquer um. Segue o link para quatro aulas de Introdução a Bioengenharia que podem ser vistas no YouTube. Esse curso infelizmente não está completo, mas muitos outros estão completos, como o Introduction for Computer Science and Programming.

Andrew Hessel introduz Biologia Sintética

Andrew Hessel, pesquisador do iGEM, introduz a Biologia Sintética na Conferência de Biotecnologia e Bioinformática de 2009 fazendo um interessante paralelo entre computação e biologia.

“Células são processadores de informações e o DNA é a linguagem de programação.”

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