FAQ #8 Como ver se a transformação gênica deu certo?

FAQ da Bioengenharia 8

Já colocamos nossos plasmídeos nos bichinhos, mas ainda não acabou. Essa é a hora de saber se tudo que fizemos até aqui deu certo!

Primeiro, colocamos eles na placa de seleção com antibiótico e só aqueles que realmente incorporaram o plasmídeo vão sobreviver porque ganharam um gene amigo de resistência ao antibiótico. Agora pegamos uma parte das células sobreviventes e fazemos um teste usando a PCR (você lembra dessa técnica, né?).
Como testar com a PCR?! Roubamos os plasmídeos dessas células e tentamos multiplicar o pedaço de DNA que foi grudado nele adicionando primers, nucleotídeos e enzimas sob aquecimento e desaquecimento. Se o nosso plasmídeo modificado tiver sido incorporado pelos micro-organismos haverá a multiplicação do pedacinho e podemos vê-los em uma eletroforese. Caso contrário, nada foi copiado e nada vai aparecer na eletroforese. Então temos o sinal de que alguma coisa não deu certo por aqui e as chances de erros deste teste são bem pequenas.

Depois vamos para um teste melhor ainda, o sequenciamento. Este teste diz exatamente qual √© a sequ√™ncia de pares de base da mol√©cula do plasm√≠deo e acabam de vez suas d√ļvidas se a transforma√ß√£o deu certo ou n√£o! O sequenciamento come√ßa parecendo um processo de duplica√ß√£o normal de DNA. Mas al√©m de cadeias molde, enzimas e nucleot√≠deos normais, h√° nucleot√≠deos especiais sintetizados (ddNTP’s) que possuem duas boas propriedades: emitem luz e interrompem o prologamento da cadeia a partir de onde foram adicionados. Ent√£o, imagine uma mol√©cula de DNA que possui um par de base A-T em um determinado comprimento e considere que a base A pertence √† cadeia molde e a base T √† cadeia complementar. Se esta base T for um nucleot√≠deo especial temos como identificar “quem √©” e “qual sua posi√ß√£o” na cadeia, pois ele emitir√° uma cor espec√≠fica para Timina e o comprimento de sua cadeia est√° interrompido na posi√ß√£o exata (n¬ļ 2 em verde).¬†Sequenciamento de DNAPodemos detectar a cor emitida atrav√©s de um espectr√≥grafo e a posi√ß√£o pelo tamanho revelado na eletroforese em gel (o sequenciador √© basicamente a uni√£o dos dois). Ou detectar o tipo de nucleot√≠deo presente n√£o pela cor, mas colocando os filamentos “lavados” por cada tipo de nucleot√≠deo em po√ßos diferentes do gel e interpretando a sequ√™ncia a olho nu/manualmente.¬†Depois de identificado o nucleot√≠deo da cadeia complementar √© poss√≠vel saber quem ocupa a mesma posi√ß√£o na cadeia molde, no caso citado √© a base Adenina.¬†Expanda esse racioc√≠nio para todas as outras bases da mol√©cula, com uma amostra grande teremos cadeias de todos os comprimentos poss√≠veis, interrompidas por um dos 4 tipos de nucleot√≠deos especiais (A, T, C, G), e assim √© poss√≠vel sequenciar toda a mol√©cula de DNA!

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Para saber mais sobre sequenciamento genético, clique aqui.

Por Otto Heringer e Viviane Siratuti.

 

FAQ #7 Como enfiar o plasmídeo nas células?

FAQ da Bioengenharia 7

Dar e receber plasmídeos não é nenhuma novidade para algumas células!

As bact√©rias costumam trocar informa√ß√Ķes gen√©ticas assim e esse processo √© chamado de conjuga√ß√£o, portanto elas j√° possuem toda maquinaria necess√°ria pra isso! Desse jeito elas aumentam muito a variabilidade e as chances de sobreviv√™ncia da popula√ß√£o.

Podemos usar esse mecanismo natural  para enfiar os plasmídeos, mas na maioria das vezes damos uma ajudinha usando choques térmicos ou elétricos.

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Para entender o choque térmico, assista o vídeo do JOVE aqui. E do choque elétrico, aqui.

Por Otto Heringer e Viviane Siratuti.

 

FAQ #6 Como ver se nossos plasmídeos incorporaram os pedacinhos de DNA?

FAQ da Bioengenharia 6

Sabendo o tamanho do plasmídeo e dos pedacinhos estimamos um tamanho para nosso novo plasmídeo e agora é só conferir se estão como esperado!

Para isso, existe uma t√©cnica de separa√ß√£o chamada eletroforese em gel, onde as mol√©culas s√£o ‚Äúpeneiradas‚ÄĚ por algum pol√≠mero (gel de poliacrilamida ou de agarose) quando se movimentam atra√≠das ou repulsadas pelos eletrodos de cargas opostas que s√£o colocados nas extremidades do gel. Ou seja, uma mol√©cula com carga negativa caminha para o eletrodo de carga positiva e vice-versa. E as mol√©culas de mesma carga correm de maneiras diferentes pelo gel de acordo com seus pesos moleculares e tamanhos, as menores e mais ‚Äúleves‚ÄĚ passam com mais facilidade pelo gel enquanto as maiores e mais ‚Äúpesadas‚ÄĚ ficam mais retidas.¬†No final, temos as mol√©culas separadas ao longo do gel e podemos comparar com a ladder (uma ‚Äúr√©gua‚ÄĚ feita de mol√©culas com pesos e tamanhos j√° conhecidos) para saber se nossos plasm√≠deos est√£o no tamanho esperado.

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Depois de confirmar pela eletroforese que nossos¬†plasm√≠deos foram modificados, precisamos ‚Äúsalv√°-los‚ÄĚ do gel para colocar nas c√©lulas. Basicamente, cortamos o peda√ßo de gel que est√° com nossos plasm√≠deos e colocamos em tubinhos com uma pequena coluna de s√≠lica dentro (imagem a√≠ embaixo). Ent√£o as mol√©culas de DNA se ligam √† coluna, fazemos uma lavagem para tirar o gel e depois dilu√≠mos o DNA para retir√°-lo da coluna!

 

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Para saber mais sobre eletroforese, assista o v√≠deo do JOVE Science¬†aqui¬†e purifica√ß√£o¬†aqui.¬†ūüôā

Por Otto Heringer e Viviane Siratuti.

FAQ #5 Como colocar os pedaços de DNA no plasmídeo?

FAQ da Bioengenharia 5

Para abrir os plasmídeos (lembrando que é um DNA circular) e depois grudar os pedacinhos de DNA que extraímos pela Miniprep e multiplicamos pela PCR, usamos as chamadas enzimas de restrição e de ligação. Isso tudo ainda fora das células, ok?!

As enzimas de restri√ß√£o reconhecem e cortam os plasm√≠deos em regi√Ķes espec√≠ficas que queremos, isto √©, cortam em determinadas sequ√™ncias de pares de base. Inclusive existem dois tipos de corte, podendo formar extremidades coesivas (cortes em comprimentos diferentes entre as duas fitas) ou cegas (corte reto na dupla fita).

Feito isso, agora usamos as enzimas de ligação para grudar as extremidades dos plasmídeos às extremidades dos pedacinhos, onde as bases se complementam.

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Legal saber também que o nome dessas enzimas estão sempre relacionados com os nomes dos organismos onde elas foram encontradas (veja a enzima EcoRI, por exemplo).

 

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Para assistir o vídeo do JOVE Science sobre enzimas de restrição, clique aqui. E enzimas de ligação, aqui.

Por Otto Heringer e Viviane Siratuti.

FAQ #4 Onde colocar esses pedaços de DNA?

FAQ da Bioengenharia 4

‚ÄúNo genoma, n√©, d√™r!‚ÄĚ. Certo, mas como? E ser√° que o genoma √© o √ļnico lugar que podemos colocar esse novo pedacinho de DNA no micro-organismo que queremos modificar? N√£o! Existe outro lugar tamb√©m e ele se chama plasm√≠deo (quem j√° jogou BioShock vai soltar umas sinapses a mais agora).

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O plasm√≠deo √© um DNA circular presente em v√°rias esp√©cies de seres vivos e √© respons√°vel por conter informa√ß√Ķes valiosas envolvendo a sobreviv√™ncia do organismo a fatores externos (como por exemplo sua resist√™ncia a um antibi√≥tico), al√©m de ser o principal ator da transfer√™ncia horizontal de informa√ß√£o gen√©tica, ou seja, a passagem de um DNA funcional de um ser vivo para outro sem haver hereditariedade (√© a√≠ que o jogo BioShock extrapola isso para seres humanos).¬†Adivinha de onde veio a ideia de usar o plasm√≠deo como transmissor – “vetor” – de informa√ß√£o gen√©tica para modificar as c√©lulas? Veio exatamente desse mecanismo natural de realizar transfer√™ncia horizontal de genes que v√°rios micro-organismos possuem, ent√£o aproveitamos para fazer a transfer√™ncia das informa√ß√Ķes gen√©ticas que n√≥s queremos!

E se vamos usar plasm√≠deos √© preciso extra√≠-los tamb√©m!¬†Os plasm√≠deos s√£o mol√©culas de DNA assim como os pedacinhos obtidos a partir de um genoma, e multiplicados pela PCR, que vamos introduzir no microorganismo, mas aqui h√° uma etapa importante durante a¬†extra√ß√£o de DNA¬†onde √© feita a separa√ß√£o do conte√ļdo plasmidial do gen√īmico.

O vídeozinho abaixo tem uma animação no ínicio e depois mostra o procedimento do isolamento do plasmídeo em lab!

[youtube_sc url=”http://www.youtube.com/watch?v=8xEDEJ0DHFA”]

Por Otto Heringer e Viviane Siratuti.

FAQ #3 Como copiar o código em laboratório?

FAQ da Bioengenharia 3

Ah√°! Essa √© a pergunta que mudou a biotecnologia. At√© conseguirmos fazer isso, n√≥s (i.e. humanidade) passamos por um caminho bem interessante¬†envolvendo pr√™mios nobel e momentos epif√Ęnicos. O videozinho¬†explica muito melhor do que esse texto corrido como funciona a metodologia pra se fazer isso, a Rea√ß√£o em Cadeia da Polimerase (Polimerase Chain Reaction), o t√£o amado e odiado (quando simplesmente n√£o funciona) PCR!

[youtube_sc url=”http://www.youtube.com/watch?v=vmlLj1aLZ7s”]

Encurtando a hist√≥ria: usando uma enzima que trabalha ‚Äúsentando‚ÄĚ no molde de uma fita √ļnica de DNA, aquecimento e desaquecimento (para ‚Äúligar‚ÄĚ e ‚Äúdesligar‚ÄĚ essa enzima) e pedacinhos de nucleot√≠deo, conseguimos fazer milh√Ķes de c√≥pias de apenas uma √ļnica mol√©cula de DNA – √© por isso que o pessoal do CSI (o seriado) consegue uma grande informa√ß√£o gen√©tica usando apenas res√≠duos quase desprez√≠veis de material biol√≥gico.

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Por Otto Heringer e Viviane Siratuti.

FAQ #2 Como extrair um pedaço de DNA desejado?

FAQ da Bioengenharia 2

Queremos pegar um pedacinho codificante de DNA (respons√°vel por alguma caracter√≠stica no organismo) de um outro peda√ßo maior de DNA. OK, mas onde fica esse outro peda√ßo? Bem, existem peda√ßos disso praticamente a todo o seu redor. Onde h√° vida, h√° informa√ß√£o gen√©tica que pode ser ‚Äúpega‚ÄĚ. Extra√≠mos ele basicamente fazemos lavagens usando solventes de diferentes ‚Äúafinidades de dissolu√ß√£o‚ÄĚ (a grosso modo) com as biomol√©culas da c√©lula at√© restar o DNA.

Se voc√™ quer saber, existem at√© kits comerciais para se fazer isso (como por exemplo a imagem abaixo), s√£o os famigerados ‚Äúkits de miniprep‚ÄĚ. ‚ÄúMini‚ÄĚ porque em geral s√£o bastante usados kits que trabalham com pequenos volumes (microlitros), mas tamb√©m existem os kits de ‚Äúmidiprep‚ÄĚ e ‚Äúmaxiprep‚ÄĚ, para volumes maiores.

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Assista o vídeo caso você queira saber mais do processo (aviso: a realidade às vezes não é algo tão excitante como você imaginava).

[youtube_sc url=”http://www.youtube.com/watch?v=P12DPa-g8Ro”]

Aliás, se você ficou com vontade de extrair DNA em casa, é bem simples, clique aqui.

Por Otto Heringer e Viviane Siratuti.

FAQs da Bioengenharia РIntrodução

FAQ da Bioengenharia 1

Preocupados com os novos amantes da biologia sint√©tica, estamos procurando materiais de introdu√ß√£o no assunto e encontramos algumas coisas interessantes! ūüôā

Por isso vamos colocar uma sequ√™ncia de posts explicativos, partindo de uma vis√£o geral e seguindo por perguntas mais espec√≠ficas. √Č um pequeno tutorial-FAQ sobre alguns fundamentos que quando entendidos ajudam bastante a entender algumas de nossas discuss√Ķes e outros posts deste blog. Serve para ajudar principalmente quem n√£o √© da √°rea de biol√≥gicas ou quem ainda n√£o se aprofundou muito neste assunto! Se continuarem com d√ļvidas, perguntem t√°?!

Lembrem-se de ativar as legendas dos vídeos, caso necessitem! Todos possuem legendas originais em inglês e alguns em português. Você pode colocá-las traduzidas quando só houver em inglês (não muito recomendado, rs). Nos vídeos do JOVE existe a opção de colocar os textos em português. Se você não sabia que o YouTube fazia isso por você, dá uma olhada aqui (dica: barrinha inferior do vídeo).

Antes de mais nada, voc√™ sabe o que s√£o e quais as rela√ß√Ķes entre nossas principais mol√©culas org√Ęnicas (DNA, RNA e prote√≠nas), certo? Se sua resposta √© n√£o, assista um desses v√≠deos!

 

[youtube_sc url=”http://www.youtube.com/watch?v=h3b9ArupXZg#t=0″]

[youtube_sc url=”http://www.youtube.com/watch?v=tMr9XH64rtM”]

 

Indo além da Estrutura 

OK, agora vamos al√©m desses conceitos b√°sicos dos v√≠deos. Mais que entender a estrutura e a din√Ęmica dessas biom√≥leculas, como os cientistas a alteram? Em linhas gerais, como se faz para modificar geneticamente um organismo?

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Vamos l√°! Primeiro pegamos um pedacinho codificante de DNA (gene) de outro organismo que tenha certa caracter√≠stica que desejamos. Para isso, extra√≠mos o DNA e depois multiplicamos s√≥ esse peda√ßo que nos interessa atrav√©s de uma t√©cnica chamada PCR (afinal, a efici√™ncia das transforma√ß√Ķes √© pequena e quanto mais material melhor). Precisamos tamb√©m extrair e abrir os plasm√≠deos (DNA circular) do organismo escolhido para receber este gene e assim receber as novas caracter√≠sticas (j√° que¬†o plasm√≠deo √© nosso principal ve√≠culo de introdu√ß√£o dos genes nas c√©lulas). Para abrir estes plasm√≠deos usamos enzimas de restri√ß√£o que cortam as mol√©culas de DNA em lugares espec√≠ficos e chamamos isso de digest√£o. Depois que tivermos v√°rios plasm√≠deos e genes, podemos grud√°-los com a ajuda de enzimas de liga√ß√£o.¬†E ent√£o, para saber se nosso novo plasm√≠deo deu certo usamos uma t√©cnica de separa√ß√£o por carga e tamanho de mol√©cula, a eletroforese em gel. Nela, as mol√©culas se acumulam em certas posi√ß√Ķes que nos dizem seus tamanhos (mergulhadas em um pol√≠mero)¬†e assim podemos identificar aquelas que correspondem ao que estimamos. Al√©m disso, fazemos testes com a t√©cnica PCR e o sequenciamento gen√©tico. Se os testes disserem que tudo que fizemos deu certo, recuperamos o material e colocamos nossos novos plasm√≠deos nos organismos, geralmente utilizando choque t√©rmico ou el√©trico. Esse passo, introdu√ß√£o de plasm√≠deos, √© a chamada transforma√ß√£o. Mas para selecionarmos somente aqueles organismos que realmente foram transformados usamos antibi√≥ticos que matam as c√©lulas que n√£o ganharam os nossos novos plasm√≠deos, j√° que n√£o possuem os genes de resist√™ncia que foram colocados neles. E no final, cada c√©lula que sobreviveu se multiplicar√°, formando col√īnias de organismos geneticamente modificados. Agora d√° uma olhada no esquema de novo e v√™ se entendeu at√© aqui!

Por Otto Heringer e Viviane Siratuti.