Brincando de Comparar Códons

Sou daquelas pessoas que simplesmente não conseguem dormir direito com um mistério. Essa é uma obsessão que provavelmente muitos cientisas (e “wannabe scientists”, como eu) têm. Às vezes ficamos obcecados com uma coisa muito importante, às vezes com uma coisa banal e muitas vezes com algo que você nunca parou para pensar direito. O mais emocionante é que qualquer resposta de uma dúvida tem aquela probabilidade mágica de revelar algo impressionante ou bem útil. Hoje (dia dessa postagem), fiquei obcecado por tentar entender “na prática” qual é a grande ideia da otimização de códons e o quanto os organismos podem ter preferências de códons diferentes.  Aqui está o registro da investigação do pequeno mistério de hoje!

Códons, Otimizações e Preferências

Antes de discorrer sobre o que andei brincando. Uma pequena contextualização ao intrépido viajante sobre o que são códons, porque eles precisam ser otimizados e o que diabos é essa “preferência de códons”.

Códons são os trios de combinações de letrinhas A,T,C e G do DNA (os nucleotídeos) que, depois de transcritos a RNA (em que a grande diferença é que os “T’s” são substituídos por “U’s”), são literalmente traduzidos em aminoácidos; ou seja: três nucleotídeos codificam um  aminoácido. A grande coisa dos códons é que eles são redundantes: existe mais de uma maneira de um aminoácido específico ser traduzido à partir dos trios de nucleotídeos. Os cientistas fizeram uma tabela espertinha que “decodifica” nucleotídeos em aminoácidos:

codons_aminoacids_table

Comece lendo do centro até às bordas do círculo combinando as letras que você for olhando pelo caminho. Por exemplo: U+A+C = Tyr, abreviação de Tirosina.

 Mas aí você se pergunta: “Querida Natureza, qual é o propósito disso!?”. A redundância da leitura de aminoácidos tem uma implicação muito importante na conservação do código genético; ela é a última barreira espertinha da contra mutações no DNA. Imagine que o “C” do códon UAC que traduz uma Tirosina fosse mutado e virasse um “U” (dando UAU): graças à redundância de tradução, o aminoácido Tirosina ainda continua sendo traduzido! Pra  se ter uma ideia de como isso é importante, uma única substituição de aminoácidos (o que pode acontecer com uma única mutação de nucleotídeos) já pode gerar doenças (pesquise sobre Anemia Falciforme).

Enfim, concluindo: existem muitos códons que podem ser traduzidos em diferentes tipos de aminoácidos. Como existem muitas opções, diferentes organismos costumam a ter preferências por diferentes códons para traduzir aminoácidos específicos – por exemplo: nós Humanos adoramos traduzir Arginina como AGA e AGG, já uma das bactérias do nosso cocô, a E.coli, acha muito mais interessante traduzir Arginina como CGU e CGC. Vai entender esses procariotos viu!

Mas porque isso acontece? Porque evolutivamente cada espécie foi selecionada em um ambiente particular, o que implica em diferentes necessidades de estabilidade do DNA em diferentes contextos, e portanto diferentes porcentagens de C e G, e A e T no genoma. Essas porcentagens direcionam quais códons os organismos preferem.

Por causa de tudo isso, quando algum cientista vai fazer o design de um pedaço de DNA, é preciso colocar a sequência no contexto do organismo a ser utilizado, deixando os códons “otimizados” para cada ser vivo – caso contrário, os genes inseridos no organismo serão pouco ou nada expressos.

Investigando leveduras

Mais profundamente, resolvi brincar dessas coisas querendo responder uma pergunta: “O quão compatível os códigos genéticos de duas espécies de leveduras podem ser?”. No caso, Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisiae.

Primeiramente eu entrei no “Codon Usage Database“. Procurando por Pichia e Saccharomyces, o site dá uma tabela com a frequência de se encontrar determinado códon a cada mil pares de base. Eu peguei os resultados e coloquei num site chamado “Text Diff” – ele compara dois textos e mostra as diferenças e igualdades entre os dois. Com a comparação, dei print screen e destaquei as frequências mais discrepantes entre as duas espécies de levedura, obtendo o seguinte diagrama:

Comparação Pichia e Saccharomyces - códons

Texto em vermelho: Pichia. Texto em Verde: Saccharomyces. Laranja – diferença de 4 a 5; Rosa – diferença de 6 a 9; Amarelo – diferença acima de 10; Códons circulados – frequências iguais.

Fui atrás de cada códon, procurando o que codifica. Cheguei na seguinte tabela:

 Pichia Versus Saccharomyces Table

Eu chamei de “eficiência de códons” o quão os códons de Pichia funcionam em Saccharomyces, tomando como “códons incompatíveis” aqueles com diferença de no mínimo 4 entre as frequências de códon em cada espécie (a marcação em amarelo na imagem de comparação das frequências) – também estou tomando como hipótese que há uma relação direta entre frequência de códon e a preferência do mesmo por determinada espécie. Cheguei nesses valores através da porcentagem do número de códons “compatíveis” (totais –  incompatíveis). De 20 aminoácidos possíveis, apenas 7 seriam seus códons prontamente compatíveis.

Ambas as espécies são leveduras, e por isso eu esperava uma maior compatibilidade natural. O problema é que eu não tenho um controle para saber se a usagem de códons de cada levedura é realmente discrepante. Por isso, fiz a mesma comparação entre Pichia e E.coli. Como esses organismos são bem mais diferentes (um é eucarioto e outro procarioto), esperei uma diferença bem maior. (veja imagem abaixo)

Comparação Pichia e Ecoli - códons

Texto em vermelho: Pichia. Texto em Verde: E.coli. Laranja – diferença de 4 a 5; Rosa – diferença de 6 a 9; Amarelo – diferença acima de 10; Códons circulados – frequências iguais.

Legenda: Laranja – diferença de 4 a 5; Rosa – diferença de 6 a 9; Amarelo – diferença acima de 10; Códons circulados – frequências iguais.

Como esperado, dá pra ver claramente o quanto E.coli e Pichia são diferentes em comparação com Pichia e Sccharomyces. Nesse panorama, eu diria em Pichia e Saccharomyces são bem parecidas. Quanto mais comparações forem feitas mais certeza se terá do quão um organismo se parece com outro.

Otimização de Códons

Apesar de eu não ter certeza da relação direta entre frequência e preferência de códon, consegui observar coisas muito interessantes: a única inviabilidade de tradução correta entre Pichia e Saccharomyces de aminoácido é o Glutamato, em que as frequências de todas as possibilidades de códons não entram na minha classificação de “códons compatíveis” (diferença de frequência menor que 3). O resto dos códons podem ser compatibilizados entre espécies usando-se versões alternativas de códon para um mesmo aminoácio! 🙂

Quando se otimizam códons para deixar um plasmídeo compatível em diferentes plataformas, faz-se exatamente isso. O problema é que mesmo assim a expressão ainda não é ótima, então em geral prefere-se “sacrificar” a compatibilidade do plasmídeo em diferentes espécies para se ter um plasmídeo com os melhores códons em cada bichinho.

Existem vários programas que fazer essa otimização de códons rapidamente, mas em geral as empresas que sintetizam DNA já incluem isso (de graça ou não) no planejamento do plasmídeo a ser sintetizado.

Conclusão

Por fim, a conclusão que tirei disso tudo é: eu ACHO que um gene de Pichia funcionaria suficientemente bem em Saccharomyes e vice-versa. No caso de não conseguirmos sintetizar os genes que precisamos já códon-atimizados, talvez valha a pena fazer uma mistureba de DNA interespécies – mas só para as leveduras!

Experiência em Biologia Sintética – Monique Gasparoto

Entrevista feita por Mira Melke.

A Biologia Sintética é extremamente motivadora. Para provar isso e para mostrar o quão importante e distinta pode ser uma experiência em Biologia Sintética acima do equador convidei uma amiga, companheira dos tempo de Biomol (Ciências Físicas e Biomoleculares) para escrever um pouquinho para a gente. 

Quem fala agora é a Monique:

Monique

Biologia sintética: impossível não se apaixonar!

Minha história com a Biologia Sintética começou como toda história de amor, umas paquerinhas para cá, um google search para lá, mas nada muito sério. A primeira vez que ouvi falar da área foi em 2009, quando nem havia descrições em português. O amor adormeceu enquanto eu me desdobrava para ser aprovada em todas as disciplinas do curso de Ciências Físicas e Biomoleculares da USP de São Carlos, do qual atualmente sou aluna do último ano. Envolvi-me em outra área de pesquisa, o mundo continuou a andar, mas quando eu menos esperava fui me reencontrar com minha paixonite dos tempos de caloura.

Como bolsista do programa Ciências sem Fronteiras, passei um ano na Boston University e além da incrível experiência de intercâmbio, tive a oportunidade de trabalhar no laboratório do professor Doug Densmore (CIDAR) e fazer parte do time do iGEM da Boston University. Eu não poderia sonhar em um lugar mais incrível para me aproximar da Synbio: estar em Boston onde as primeiras bases da área foram lançadas, fazer pesquisa em um laboratório exclusivamente de Biologia Sintética – em que todo mundo tem o site do Registry nos favoritos(!), assistir a palestras e seminários dos pesquisadores referência da área, como o Jim Collins, com quem dividíamos espaço de laboratório , visitar o Headquarters do iGEM e muitos outros aspectos me fizeram ter a certeza de que a Synbio veio para ficar não só na minha vida, mas certamente na de todos os que a conhecem.

O projeto que desenvolvemos para a competição trabalhava os três pilares do iGEM: construção, caracterização e compartilhamento das informações do Registry. Para isso introduzimos na competição o método de Clonagem Modular (MoClo) descrita por Weber et al, propusemos um protocolo de caracterização padrão para circuitos com proteínas fluorescentes usando citometria de fluxo e esboçamos uma página comum a ser usada no Registry em que as  informação sobre as partes poderiam ser geradas automaticamente a partir do Clotho, uma plataforma para Biologia Sintética desenvolvida pelo meu orientador, Doug Densmore.  Mais detalhes vocês podem conferir na nossa Wiki.

Foi um período de aprendizado intenso, porque era a primeira vez que o Densmore Lab apoiava um time de WetLab, a tradição dos anos anteriores era o time de software. Éramos dois alunos de graduação orientados por três alunos de doutorado e uma pós-doc, e nunca imaginei participar de um ambiente tão colaborativo e estimulante. É claro que parte disso é devido à excelente estrutura do laboratório e às facilidades dos meios de pesquisa, quem não ficaria feliz e contente com sequenciamentos de DNA que ficam prontos no mesmo dia e enzimas que chegam ao laboratório em no máximo 48h após a encomenda!? Mas o diferencial dessa experiência veio da oportunidade de vivenciar um ambiente de apaixonados por Biologia Sintética e perceber como eles desenvolvem suas pesquisas: com muita competência, muito estudo e muita motivação!

O que mais me cativa nessa área da ciência que agrega à biologia molecular conceitos e ferramentas da engenharia é que tão importante quanto o conhecimento técnico, é a inovação e a criatividade. Características que eu pude testemunhar de perto em todos aqueles que participaram do iGEM, e que ficaram ainda mais nítidas quando na fase final da competição em Boston, times do mundo inteiro, desde do Leste Asiático até a América do Sul se reuniram para sonhar, discutir e compartilhar suas propostas para tornar o mundo melhor, “one part at a time”.

Talvez não haja outro grupo de (malucos) cientistas que acredite tanto que seus projetos e conhecimentos podem mudar o mundo. Aí está o brilho da Synbio, que uniu pesquisadores de fronteira que não queriam mais ficar confinados às suas especialidades, mas decidiram sair de sua zona de conforto e ousar e empreender em grupos multidisciplinares.  A ousadia desses biólogos sintéticos é tão grande que são capazes de investir cifrões de patrocínio e meses de trabalho em uma competição em que o grande prêmio, aos olhos dos mais céticos, é somente um BioBrick gigante. É como dizem por aí, a biologia sintética tem razões que a própria razão desconhece.

Especulações e Biologia Sintética

images (1)Minha vontade de discutir e aprender biologia, especialmente tudo aquilo que envolve a palavra DNA já me acompanha antes mesmo de entrar na faculdade. A solução que encontrei para suprir essa vontade e viagens por esse mundo, até então feitas apenas acompanhado de meu computador foi prestar uma prova de seleção para dar aulas de biologia no cursinho da UNESP.

Comecei dar aulas em 2012 e o melhor, da matéria que mais gosto, citologia e genética, afinal, eu queria falar de células, DNA, Mendel e não sobre insetos que possuem três pares de patas e um de antenas.

Certo dia, véspera de feriado e com chuva, resolvi passar um filme para discussão. O filme escolhido foi GATTACA. Ao final do filme, um aluno com os olhos arregalados que aparentavam demostrar grande interesse pelo assunto, levanta a mão e pergunta: “Esse tipo de previsão é possível?”

[youtube_sc url=”http://www.youtube.com/watch?v=L8yYjKa36No”]

GATTACA trata-se de um filme hollywodiano de ficção científica, infelizmente não poderemos prever a expectativa de uma pessoa ao nascer, mesmo uma década após a conclusão do Projeto Genoma. Hoje sabemos que os organismos dependem de dois tipos de informação, uma delas é o código genético e a outra são estímulos recebidos do meio ambiente em que vivem, sobre o qual não podemos fazer previsões.

images (3)

O Projeto Genoma Humano, considerado por muitos a bola de cristal do futuro, foi cercado de promessas e esperanças da mídia e de Wall Street para o lançamento de medicamentos personalizados e previsões sobre riscos de doenças como Alzheimer e cânceres. Tal projeto prometia revolucionar a medicina, ao estilo do filme de ficção científica.

Pouco mais de dez anos já se passaram desde sua conclusão, uma batalha inciada em 1990 travada entre a iniciativa pública e a privada, que chegou ao fim depois de três bilhões de pares de bases sequenciadas e três bilhões de dólares gastos, além de uma briga entre o famoso James Watson e Craig Venter, marinheiro nas horas vagas. Para Nicholas Wade do NYT, o projeto falhou e não trouxe os benefícios tão esperados.

Embora as promessas aguardadas por muitos não chegaram, ele trouxe avanços significativos para a área da biologia. O Projeto Genoma Humano foi um projeto  interdisciplinar, contando com a participação de cientistas de diversas áreas como computação, matemática, biologia entre outras, além da colaboração de laboratórios ao redor do mundo, inclusive do Brasil. Ele contribuiu significativamente para o avanço na área de biocomputação e nas técnicas de sequenciamento de DNA, além de permitir a democratização da informação por meio do acesso gratuito ao sequenciamento humano e de diversos outros seres vivos. Genes agora não precisam mais ser estudados de forma individual, hoje dispomos de uma extensa lista de partes biológicas que tem permitido o avanço na área de biologia de sistemas, que promete revolucionar o modo de tratar doenças e o sistema de saúde conhecido atualmente.

Tal fato nos faz refletir sobre as promessas em torno da área de biologia sintética, a qual acredita-se ser capaz de solucionar muitos de nossos problemas atuais como o elevado preço do petróleo, desastres ambientais e uma população cada vez maior para se alimentar. Ao invés de manipular alguns genes de cada vez, como se tem feito a mais de três décadas, graças a descoberta das enzimas de restrição, o campo da biologia sintética vai além e tem como objetivo recodificar e redesenhar circuitos genéticos. Parece não haver limites do que podemos fazer, no entanto tais circuitos não se comportam como circuitos eletrônicos. Sistemas assim costumam ter muita interferência e comportamento imprevisivel, além de estarem sujeitos a mutações. Segundo o cientista Christopher Voigt, “A célula é uma espécie de burrito, tudo dentro dela está misturado” e sujeito a uma variedade de reações bioquímicas, tal complexidade tem limitado o tamanho dos circuitos criados. Drew Endy, um dos pioneiros do ramo, acredita que a biologia sintética só atingirá seu potencial quando os cientistas forem capaz de prever com exatidão como um circuito genético se comportará dentro de uma célula. Para isso tem-se aplicado estratégias de engenharia, como a padronização, dissociação e a abstração.

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Promessas da Biologia Sintética

Outro problema enfrentado é a caracterização das partes biológicas. Embora o Registry of Standard Biological Parts possua mais de cinco mil partes disponíveis, menos da metade tem seu funcionamento confirmado. Caracterizar algumas partes biológicas pode levar anos e não gerar dados para uma publicação. Na cultura do “publique ou pereça”, o que temos é uma grande quantidade de trabalhos, porém com poucos dados reproduzíveis e úteis.

Embora o custo de sintese e sequenciamento tenham caido de forma significativa facilitando o avanço da área, não podemos negar que ainda há muitas pedras no caminho. Nosso conhecimento ainda é limitado mesmo para compreender por completo o comportamento de organismos mais simples como bactérias e fungos unicelulares. Assim como o projeto genoma a biologia sintética também está rodeada por especulação e não podemos dizer onde estaremos em dez anos. Mas uma coisa é certa, aprendemos a ler agora estamos escrevendo código genético.

Referências

  • The Promise and Perils of Synthetic BiologyJonathan B. Tucker and Raymond A. Zilinskas
  • Synthetic biology: from hype to impact – Timothy S. Gardner
  • Five hard truths for synthetic biology – Roberta Kwok
  • Initial impact of the sequencing of the human genome – Eric S. Lander
  • http://web.mit.edu/newsoffice/2012/complex-biological-circuit-1007.html

SynbioBrasil na Campus Party 2013 e no Grok Podcast!

Autores Colaboradores: Cauã Westmann e João Molino

No dia 29 de janeiro fomos convidados para participar do evento Campus Party, no Parque Anhembi, SP, “o maior acontecimento tecnológico do mundo” segundo o site (discutiremos isso mais tarde…)! Criada há 16 anos na Espanha, ela atrai anualmente geeks, nerds, empreendedores, gamers, cientistas e muitos outros grupos criativos que se reúnem para acompanhar centenas de atividades sobre Inovação, Ciência, Cultura e Entretenimento Digital. O evento tem duração de 5 dias e um espaço para acampamento que reuniu cerca de 8.000 “campuseiros” em barracas.

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Mesa com o Carlos Hotta e o Mateus Lopes na Campus Party – as pessoas por trás do começo do SynbioBrasil.

Nosso grupo foi convidado para participar de uma apresentação na sessão da Galileu (sim, a mesma da revista!), apresentando a Biologia Sintética de forma sucinta e comparando-a com alguns aspectos operacionais da computação, buscando aproximar o público com a área. Os palestrantes foram o professor doutor da USP Carlos Hotta (IQ-USP) e o PhD em biotecnologia Mateus Schreiner Garcez Lopes (Brasken), dois grandes ponta de lança da Biologia Sintética no Brasil que fizeram um ótimo trabalho!
Bom, a apresentação ocorreu somente às 15h45min e como chegamos bem cedo, tivemos tempo suficiente para passear por muitos stands e apresentações no local. Grandes empresas patrocinaram o evento e marcaram sua presença por ali como Microsoft, Intel, IBM, Nvidia, Petrobrás, Vivo, Sebrae entre outras. Vimos centenas de computadores tunados, temáticos (veja a foto da CPU mafiosa) e com configurações de hardware extraordinariamente potentes; impressoras 3D e alas inteiras dedicadas a gamers. Entretanto, apesar dos 76 mil metros quadrados de área disponível do Parque Anhembi e do grande montante de investimentos envolvidos, o evento deixou muito a desejar…

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Não, não é uma máquina de doces do Scarface. É um CPU.

Primeira grande pisada de bola: não havia uma rede de Wi-fi livre! É difícil de acreditar que um evento voltado para inovação e tecnologia não forneça conexões sem fio abertas. Pois bem, só estavam disponibilizados cabos para conectar o computador à rede, mas  em uma era na qual tablets e outros portáteis são cada vez mais comuns, a ausência do Wi-fi prejudicou bastante nossas atividade e, principalmente, cobertura do evento! O Synbio Brasil que não pôde twittar nada durante o evento em decorrência disso. #chateado

Segundo, o espaço foi subutilizado. Grandes áreas eram destinadas a computadores que ficaram vazios na maior parte do tempo ou a grandes telões que mostravam apenas as expressões faciais de jogadores que competiam no evento. Além disso, muitos dos stands apresentavam pouquíssimo conteúdo, ocupando seu espaço com arcades, video-games, pinballs e máquinas de pegar bonequinhos de pelúcia. Até um enorme espaço reservado para um sorteio de automóvel havia ali.
Por último, houve certa desorganização operacional, principalmente no que tange à mobilidade do público dentro do Parque. Havia uma divisória entre os setores que apresentava seguranças e detectores de metais totalmente necessários, mas com apenas uma passagem estreita para quem ia e vinha em sentidos opostos, gerando grandes filas desnecessárias.

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Pedro #chatiado por causa do wi-fi e de alguns estandes bobinhos. #GrumpyPedro

É claro que houve várias atividades legais, como a palestra do 2° homem a pisar na lua, o ex-astronauta Edwin Buzz Aldrin,  e outros eventos com temas diversos sobre tecnologia, inovação e empreendedorismo e tudo isso foi muito válido. Muitas pessoas levaram suas ideias, produtos, computadores tunados, monitores triplos, jogos e programas e se beneficiaram muito da troca de experiências com os outros participantes. Ponto positivo novamente. Além disso, é importante ressaltar que ficamos apenas um dia no local e, por isso, opinamos sobre o que vimos apenas neste período de tempo, não conseguindo fazer um review sobre o evento como um todo.

O grande ponto forte da Campus Party desse ano foi promover o contato de milhares de pessoas para trocarem informações e experiências sobre os mais diversos assuntos e esse é um caminho importante para o desenvolvimento educacional, cultural e tecnológico do país. No entanto, senti que esse diálogo tão enriquecedor foi bastante fraco quanto à relação entre o público e às empresas presentes.

Faltou algum elemento de coesão… A ideia de que os participantes seriam atraídos apenas por brindes e entretenimento eletrônico foi um grande equívoco. Lá não estavam consumidores da velha definição capitalista, mas sim, felizmente, consumidores de ideias, pessoas inquisitivas e cheias de novas perspectivas. E para atender às suas demandas a logística claramente precisa se atualizar. Mas palma, palma, não criemos caniço (Chapolin et al, 1973)! Não há evento melhor do que a Campus Party para promover essa atualização do sistema!

Desse modo, a experiência foi muito válida e esperamos estar lá novamente em 2014 com muitas novidades para ver e mostrar!

EDIT: Cheque aqui o vídeo da palestra no evento (Obrigado pelo link Mariana Fioravanti!):
[youtube_sc url=”http://www.youtube.com/watch?v=VSvin1OzzIU”]

GrokPodcast

grok

Recentemente, também, eu, Pedro Medeiros, e Otto Heringer pudemos ter a chance de participar do Grok Podcast. A página, sob comando de Carlos Brando e Rafael Rosa Fu, traz podcasts relacionados a tecnologia, principalmente tecnologia da informação, com podcasts nos quais profissionais explicam e discutem um determinado tópico de sua especialidade em uma série de episódios.

O termo Grok tem um significa curioso. De acordo com a própria página ele é proveniente do livro “Um estranho em uma terra estranha”, de Robert Heinlein, e que dizer “Entender algo tão completa e profundamente que o observador e o objeto observado se tornam um só”, com certeza uma sensação da qual nós, estudiosos apaixonados de um tema, adoramos estar próximos(e um termo que, a partir de agora, passo a adotar)!

Tomei notícia do GrokPodcast ainda em meados de 2012, quando pesquisava assuntos relacionados ao Arduino e, por acaso, noticiei um capítulo cujo título era “Singularidade e Biologia Sintética”, na qual dois entusiastas conversavam sobre o tema. Entrei em contato e, depois de algum tempo e algum esforço técnico, gravamos os episódios.

Estas foram mais duas ações com o objetivo de divulgar e informar, gerando material de qualidade (assim espero, haha) em língua portuguesa, tarefa na qual nós do SynbioBrasil já nos dedicamos.

Abaixo vai o link do primeiro episódio do nosso podcast!

SynbioBrasil no GrokPodcast Parte 1!

Aventuras em Biologia Sintética

Drew Endy

Eu considero os quadrinhos como uma das formas mais interessantes de se narrar uma história. São também uma ótima forma de divulgar ciência de uma maneira didática e divertida.

Drew Endy um dos pais da biologia sintética (e do Registry of Parts), juntamente com Isadora Deese (ambos do MIT) elaboraram o quadrinho Adventures in Synthetic Biology. E tem mais: o quadrinho foi publicado no website da prestigiada revista Nature.

Confira Adventures in Synthetic Biology e aprenda de maneira didática o que são biobrickPoPs, entre outros conceitos básicos.

 

Links possivelmente interessantes:

 

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