Inside iGEM: A Competição

Esse é o primeiro da série de três posts “inside iGEM”, em que vamos mostrar um pouco mais a fundo sobre o que é a competição e como ela funciona.

A Inscrição

Tudo começa com a inscrição de um time, que pode ser composto por estudantes de graduação de várias áreas: desde matemática aplicada até a própria Biologia, a idéia é que quanto mais interdisciplinar for o grupo mais interessante poderá ser o projeto. Não é preciso que um time seja de uma única universidade ou que uma instituição tenha apenas um time, basta apenas ter uma idéia, um projeto, e instrutores e orientadores para apoiá-lo. E como nem só de flores vive o mais ambicioso projeto, é preciso patrocínio. É comum o patrocínio ser público, uma vez que as equipes representam universidades, mas existem muitos investimentos de empresas interessadas na pesquisa.

Para a inscrição, é cobrada uma taxa de dois mil dólares mais cerca de $225USD por estudante para o atendimento nas competições regionais (uma modificação deste ano na competição) além de mais $425USD para outros participantes. Os mesmos valores são requisitados na fase mundial da competição.

O Evento no MIT.

O evento no MIT.

Escolas de nível médio (equivalentes às high schools americanas) também podem participar. A partir deste ano foi criada uma divisão para essa categoria, que tem participado desde 2008 no iGEM.

O Trabalho

Após a formação de um time, são dados aos estudantes inscritos um kit de partes biológicas do registro de partes biológicas padrão (ver último post) em meados de abril . Eles devem usar essas partes e novas partes com design próprio para construir sistemas biológicos que operam em células vivas, como os que já mostramos aqui a nivel básico em posts antigos (ver Osciladores, e Uma Bactéria que Conta).

Da data de entrega do kit até o fim de setembro, época em que a wiki (exemplo: Bactoblood, da Universidade de Berkley ) que cada time deve fazer é congelada, o time precisa enviar a descrição de seu projeto, propostas de segurança, que precisam ser aprovadas, documentar a parte padrão e registrar o BioBrick no registro de partes padrão. Então em outubro começa a fase regional, uma outra modificação da competição na edição deste ano, para depois haver então  o campeonato global no MIT.

A Competição

Em novembro ocorre o evento que dura cerca de dois dias na sede do MIT. Houve certa discussão nas modificações que ocorreram da edição deste ano para mudar o local do evento para as ilhas Bahamas (!), contudo foi decidido por manter a competição em solo americano devido a possíveis problemas logísticos e de vistos (para que não sabe as ilhas Bahamas é um país!). Nas Bahamas ou não, em toda competição do iGEM, como o próprio site oficial sobre o evento faz questão de ressaltar, os estudantes além de passar por uma experiência cultural, acadêmica e profissional incrível, têm a oportunidade de se divertir um bocado (Veja um dos vídeos do iGEM de 2007).

As competições do iGEM, diferentemente das competições habituais, não têm um foco principal competitivo, mas meritocrático: os times não são à priori julgados comparativamente, mas têm seus prêmios ganhos através do comprimento de requisitos básicos que fazem o grupo merecedor de uma medalha. Os critérios de julgamento para conceder os tipos de medalhas aos grupos orbitam principalmente em torno do BioBrick e à medida em que se conquista uma medalha melhor, as exigências do BioBrick tornam-se maiores. Em resumo os pré-requisitos são:

Medalha de Bronze: Além de realizar a inscrição, ir ao evento e apresentar um pôster, é preciso detalhar no mínino um novo BioBrick padrão no registro de partes  cumprindo todas as normas estabelecidas.

O BioBrick Trophy.

o BioBrick Trophy.

Medalha de Prata: Demonstrar que o BioBrick funciona como esperado e caracterizar (i.e. explicar como funciona) a operação dele in vivo.

Medalha de Ouro: Caracterizar um BioBrick já existente ou melhorá-lo e colocá-lo de volta no registro de partes, e também desenvolver um documento com uma nova técnica padrão que ajude no design, ou caracterização, ou construção, ou análise, ou modelagem, ou simulação, ou compartilhamento (ufa!) de um BioBrick ou do dispositivo biológico envolvido. Além de tudo isso, outro requisito é a cooperação: ajudar outro time do iGEM; como por exemplo na caracterização de um BioBrick e na modelagem ou simulação do sistema da outra equipe competidora (companheira!?) é um grande contribuinte para o prêmio dourado.

Mas como toda boa competição, além das medalhas há uma avaliação do best of the bests dentre as categorias de projeto, podendo dar o título de Area Prize ao time com maior destaque em sua área. As áreas de premiação são:

  • Melhor projeto de Alimentação ou Energia (Best Food or Energy Project).
  • Melhor projeto Ambiental (Best Environment Project).
  • Melhor projeto de Saúde ou Medicina (Best Health or Medicine Project).
  • Melhor projeto Industrial (Best  Manufacturing Project).
  • Melhor nova Área de Aplicação (Best New Application Area).
  • Melhor Avanço Fundamental (Best Foundational Advance).
  • Melhor projeto de Processamento de Informação (Best Information Processing Project).

Há também prêmios especiais para destaques de projetos:

  • Melhor novo BioBrick Natural (Best New BioBrick Part, Natural).
  • Melhor novo BioBrick ou Dispositivo Artificial (Best New BioBrick Part or Device, Engineered).
  • Melhor avanço em Práticas Humanas (Best Human Pratices Advance).
  • Melhor Medida Experimental (Best Experimental Measurement).
  • Melhor Modelo (Best Model).
  • Melhor Wiki (Best Wiki).
  • Melhor Poster (Best Poster).
  • Melhor Apresentação (Best Presentation).

Os maiores prêmios, baseados no desempenho geral na competição, são os troféus de primeiro lugar (imagem acima) e primeiro de vice-campeão e segundo vice-campeão. Além disso, existe também um prêmio especial para a área de desenvolvimento de ferramentas de softwares, cujas medalhas são “coloquialmente chamadas de mousepads” como o site oficial jocosamente menciona.

Após o evento, os participantes são fortemente encorajados a escrever um artigo e publicá-lo em revistas como o Journal of Biological Engineering, e a ir a conferências como a conferência anual do Institute of Engineering and Technology.

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Secretaria de Partes Biológicas Padrão

Já comentei em posts anteriores sobre os Biobricks, as partes biológicas padrão da biologia sintética. Dentro desse contexto, foi fundado em 2003, no MIT, a Secretaria de Partes Biológicas Padrão (Registry of Standard Biological Parts) para depositar as partes genéticas utilizadas na montagem de dispositivos e sistemas sintéticos. A secretaria contém mais de 3400 partes que podem ser trocadas por inúmeros laboratórios cadastrados e espera-se que todos contribuam com dados e novas partes para melhorar o repositório.

A secretaria oferece muitos tipos de partes biológicas, incluindo plasmídeos, primers, promotores, domínios de proteínas, sítios de ligação de ribossomos, riborreguladores, genes repórteres e etc… (veja a lista).

Entre os objetivos de criação do Registro estão: (i) possibilitar a engenharia sistemática da biologia, (ii) promover o desenvolvimento transparente e aberto de ferramentas de engenharia biológica e (iii) para construir uma sociedade que, produtivamente e democraticamente, possa aplicar tecnologias biológicas.

Atualmente mais de 120 laboratórios do mundo inteiro pertencem à comunidade dos Biobricks. Este ano, o Laboratório de Bioprodutos da USP foi o primeiro laboratório do país a fazer parte dessa comunidade. Algumas das nossas construções genéticas já  estão sendo feitas em formato biobrick para que possamos receber partes e contribuir com partes também. Na próxima segunda, receberemos uma das responsáveis pela Secretária, Meagan Lizarazo que irá dar uma palestra sobre biologia sintética, biobricks, iGEM e outros assuntos relacionados.

Não percam esta oportunidade!

Palestra de pesquisadora do MIT sobre biologia sintética

Nesta segunda-feira, às 10:00 no anfiteatro 2 do ICBII (no centro didático anexo) teremos o grande prazer de receber a pesquisadora do MIT Meagan Lizarazo, que falará sobre Biologia Sintética, iGEM, Registro de Partes Padrão e outras coisas interessantes.

Não percam!

4.a reunião do synbiobrasil: processamento de sinais

Está confirmada a nossa próxima reunião, dia 24/03/2011 às  3 pm na sala 101 do ICBII. O tema será Processamento de sinais e se iniciará com uma palestra dos Prof. Vitor do Nascimento e Prof. Cássio Lopes do Departamento de Engenharia Elétrica da Poli. Será discutido um pouco de estimação e sistemas dinâmicos e pretende-se fazer um paralelo com o que já foi discutido sobre biologia sintética.

Até lá!

Problemas com PCR!

Após desenhar o seu primer,  montar a sua reação e programar o termociclador, você pode enfrentar problemas para otimizar as sua condições de PCR. Algumas simples ações podem resultar em um produto de PCR específico. Estas são as questões mais comuns aqui no laboratório:

1. Estou tendo (muitos) fragmentos inespecíficos maiores do que o esperado. O que fazer?

– Diminuir o tempo de anelamento da reação;

– Aumentar a temperatura de anelamento (aumento 2 graus a cada teste);

– Diminuir o tempo de extensão;

– Colocar menos primers;

– Checar e colocar menos DNA;

2. Estou obtendo fragmentos inespecíficos menores do que o esperado. O que fazer?

– Aumentar a temperatura de anelamento;

– Aumentar o tempo de anelamento;

– Aumentar a temperatura de extensão;

– Aumentar a temperatura de extensão para 74-78 oC;

– Colocar menos primers e/ou menos DNA.

3. A reação estava funcionando antes, mas agora eu não obtenho nenhum produto.

– Tenha certeza que todos os componentes estão na reação (tampão, DNA, primers…);

– Teste um novo Master Mix ou uma nova solução de dNTP (são sensíveis a descongelamentos consecutivos);

– Utilize um estoque novo de primers;

– Diminua sua temperatura de anelamento 6-10 oC, se não obtiver nenhum fragmento verifique todas os componentes.

Nos próximos posts vou comentar sobre técnicas de PCR: como RT-PCR, deleção de genes…

Dispositivos sintéticos: osciladores

ResearchBlogging.org
Um oscilador eletrônico é um circuito elétrico que produz um sinal eletrônico repetitivo, frequentemente uma onda senoidal ou uma onda quadrada. Eles são amplamente utilizados em aparelhos eletrônicos, incluindo aparelhos de transmissão de rádio e televisão.

Stricker e colaboradores (2008) descrevem a construção de um oscilador sintético biológico. Para isso, uma construção muito interessante foi utilizada, baseada em um promotor híbrido Plac/ara.  Este promotor possui dois operadores que respondem a dois sinais: ele é ativado por AraC na presença de arabinose e é reprimido por LacI na ausência de IPTG. Seguido a este promotor foi clonado os genes araC, lacI e o gene codificador da proteína luminescente GFP. Um pulso de IPTG foi utilizado para sincronizar as células, dessa maneira, AraC é traduzido resultando na ativação do sinal luminescente de GFP. Por outro lado, AraC ativa também a expressão de lacI resultando na repressão de araC e gfp, cessando o sinal luminescente. Como Lac I causa a repressão do próprio lacI, este acaba se reprimindo e um novo ciclo se reinicia (ver figura abaixo).

O período de oscilação pode ser ajustado modificando a concentração do indutor, por ex, podendo variar o período de 13 a 58 minutos. Na Figura acima o gráfico apresenta um período de 40 minutos. O mais interessante, para mim, é que o tempo de geração das bactérias do experimento varia  de cerca 22 a 27 min, assim, a informação e o sincronismo contido no oscilador passa de geração em geração.

Foi verificado que a indução da oscilação foi muito rápida (cerca de 5 min) e inicialmente bem sincronizada, analisando cada célula individualmente. A amplitude da oscilação foi caindo com o progresso do experimento, devido a dessincronização gradual de cada célula da colônia, como já era de ser esperar. Desse fenômeno, emerge um próximo tópico da biologia sintética, a comunicação célula-célula através do desenvolvimento de mecanismos de quorum sensing sintéticos. Assim, a próprias células podem se comunicar para coordenar e sincronizar o seu comportamento. Mas isso é assunto para posts futuros.

Stricker J, Cookson S, Bennett MR, Mather WH, Tsimring LS, & Hasty J (2008). A fast, robust and tunable synthetic gene oscillator. Nature, 456 (7221), 516-9 PMID: 18971928

Como desenhar um primer? E como montar uma reação de PCR?

No post passado eu comentei sobre a técnica de PCR e de como programar um PCR. Neste post eu vou um pouco mais adiante e vou falar sobre como desenhar um iniciador (primer) e como montar uma reação de PCR.

O desenho do primer tem que ser feito com muito cuidado para garantir o futuro do projeto, erros no desenho podem ser percebidos apenas muito tempo depois, após muito esforço e dinheiro já ter sido gasto no projeto. Por isso, realize essa tarefa com muito cuidado, tendo em vista todo o projeto.

A primeira coisa é pegar a sequência de interesse no GenBank, como por exemplo para o gene codificador da enzima xilose isomerase de Escherichia coli. Conheça o gene, busque artigos sobre ele, veja os genes que estão envolta, como ele é regulado,… Depois salve a sequência do gene e mais ou menos 200 bp envolta dele em um documento word. Encontre o start códon, o stop códon, promotor,… e decida a sua estratégia de clonagem.

Para desenhar primers para amplificar o gene inteiro você precisará de regiões envolta do gene. Além disso existem uma série de regras a que você precisa ficar atento para desenhar o primer como: composição de G-C, tamanho do primer, temperatura de anelamento, formação de dímeros e estruturas secundárias e muito mais. Para este trabalho, eu recomendo utilizar um software, o FastPCR. Um software livre (gratuito) e amigável.

É preciso apenas colocar a sua sequência de interesse e pedir para que ele desenhe os primers, depois você precisa checar se aquela sequência amplifica a sua região de interesse. Para a encontrar o primer reverso na sua sequência tem uma ferramenta para obter o reverso complementar da sequência, já que as sequencias de primers são dadas no sentido 5´ – 3´.

Finalmente, você pode fazer um PCR in silico, para isso, volte para o Genbank e copie toda a sequência do genoma da bactéria desejada (isso pode demorar alguns minutos) e passe para o FastPCR para fazer o PCR in silico com os primers desenhados. Com isso, você pode verificar possíveis regiões amplificadas pelo seu par de primers.

Depois de mandar sintetizar os primers, você pode fazer um programa como mostrado no post anterior. Para a reação PCR você deve seguir o protocolo da sua Taq polimerase comprada. Vale a pena ressaltar que para amplificações de genes que serão expressos posteriormente, recomendo uma Taq polimerase de alta fidelidade.

No próximo post vou comentar sobre erros e soluções comuns que ocorrem com reações de PCR.

O que é um PCR? Como montar um programa de PCR?

Polymerase chain reaction ou reação da polimerase em cadeia (PCR) é técnica de biologia molecular utilizada para amplificar (aumentar o número) de um ou de alguns pedaços de DNA em várias ordens de magnitude, gerando milhões de cópias de uma sequência particular de DNA.

Utilizando um termociclador (aparelho que permite mudanças rápidas de temperatura), uma DNA polimerase, um par de iniciadores (primers) e dNTP´s (deoxinucleotídeos, que formarão a nova molécula de DNA) é possível sintetizar in vitro DNA a partir de uma fita molde.  Veja o vídeo no youtube.

Diz a lenda que Kary Mullis teve a idéia do PCR em um daqueles momentos de ócio produtivo enquanto surfava nas ondas do Sul da Califórnia. Um ano mais tarde, 1983, a sua idéia virou realidade através do desenvolvimento da primeira máquina de PCR. Dez anos mais tarde, 1993, Mullis também foi surfar após receber a notícia que havia sido ganhador do prêmio Nobel pela sua invenção. Essa é uma ótima desculpa para não trabalhar aos finais de semana no laboratório! (rs)

A partir do programa de PCR básico abaixo é possível desenhar um programa específico para seu iniciador e fragmento a ser amplificado. No passo (step) 2, ocorre a denaturação do DNA, No passo 3, ocorre a ligação do iniciador ao seu DNA, para isso é preciso calcular a temperatura de anelamento do seu iniciador. Existe um cálculo baseado na composição dos iniciadores (Ta = 2(A + T) + 4(C + G) – 5), mas existem alguns softwares que calculam para você (porém esta temperatura não deve ser abaixo de 50oC, para evitar ligações inespecíficas). Após a ligação dos iniciadores ao DNA, irá ocorrer a síntese de DNA pela DNA Polimerase, normalmente se utiliza a Taq polimerase que possui uma temperatura ideal de 72oC. O tempo de elongamento da sua sequência depende do tamanho dela, calcula-se cerca de 1 min para cada 1000 pares de base (não menos de 30 segundos). Finalmente, este ciclo será repetido 30 vezes.

Programa básico de PCR:

Step         Temperature (°C)      Time (min)

1                     95                                    2:00

2                     95                                    0:30

3                     55                                    0:30

4                    72                                      1:00

5                    Go to step 3,                    30 times

6                     4                                        forever

No próximo post vou comentar sobre o desenho de iniciadores (primers) e como montar uma reação de PCR!

Reunião no dia 10/03, dispositivos sintéticos: osciladores e dinâmica

Olá pessoal, está confirmada para o dia 10/03, logo após o carnaval, a nossa terceira reunião do Synbio Science Club. As reuniões voltarão a ser na sala 101 aqui no ICBII na USP.

  • 10/03/2011, 3 pm, Oscillators & Dynamics

A Synthetic Oscillatory Network of Transcriptional Regulators. Elowitz MB, Leibler S. Nature. 403:335-8. (2000).

A fast, robust and tunable synthetic gene oscillator. Stricker J, Cookson S, Bennett MR, Mather WH, Tsimring LS, Hasty J. Nature. 456:516-19 (2008).

Nos vemos lá!

Clube de Biologia Sintética da Universidade de São Paulo!

Agora é oficial! Foi aprovado pelo conselho do Departamento de Microbiologia da Universidade de São Paulo o nosso Clube Científico de Biologia Sintética. A partir de agora, poderemos divulgar, reservar uma sala para as reuniões e receber nossos colegas da Poli e outros Institutos para discutirmos synbio!

SynbioBrasil Science Club: Participe!

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