Polimerase Por Segundo

ResearchBlogging.orgA Biologia √© imprecisa por natureza, e vice versa. Isso √© uma grande dificuldade ao se fazer design de sistemas biol√≥gicos sint√©ticos; aquilo que √© muito bonito no papel √†s vezes nunca pode ser feito por motivos obscuros e por excesso de ru√≠do dos sinais do sistema. N√£o d√° pra prever. Na tentativa de deixar dispositivos sint√©ticos mais previs√≠veis, a Biologia Sint√©tica tenta padronizar n√£o somente partes biol√≥gicas, mas tamb√©m os sinais que a comp√Ķem a din√Ęmica de seu sistema. Esses sinais s√£o justamente a passagem de informa√ß√£o entre DNA e o fen√≥tipo desejado, mas… como diabos deixar isso mais preciso e medir a velocidade dessa passagem de informa√ß√£o? Como medir “Polimerases Por Segundo”?

Padronização da Transmissão de Informação

Independente do que um aparelho el√©trico fa√ßa, existem sinais “universais” que pertencem a todos eles: varia√ß√Ķes na diferen√ßa de potencial, na corrente, no campo el√©trico e etc. A transmiss√£o de informa√ß√£o entre os dispositivos eletr√īnicos que comp√Ķem esse aparelho s√£o dadas justamente atrav√©s desses sinais, fazendo todo o sistema el√©trico funcionar. Em circuitos gen√©ticos, sinais an√°logos √† corrente el√©trica s√£o as taxas de transcri√ß√£o e tradu√ß√£o, ou mais especificamente, a velocidade com que – respectivamente – uma polimerase e um ribossomo “le√™m” seus nucleot√≠deos. O problema √© que esses sinais (as taxas de transcri√ß√£o e tradu√ß√£o) n√£o s√£o bons como transmissores de sinais. Entenda o porqu√™:

PoPS e RiPS: Qual é o sentido disso!?

Para que um transmissor de sinal seja bom, ele precisa facilitar com que dispositivos possam ser facilmente combinados em um sistema – al√©m de ser algo “universal”, como foi dito anteriormente. Foi a√≠ ent√£o que, usando experi√™ncias da engenharia, os bi√≥logos sint√©ticos cunharam o termo “PoPS” (Polimerase Per Second – Polimerase Por Segundo) e “RiPS” (Ribossome Per Second – Ribossomo Por Segundo). Muitos pesquisadores acham que a cria√ß√£o desses novos termos √© como “reinventar a roda”: qual seria a grande diferen√ßa entre isso e as cl√°ssicas taxas de transcri√ß√£o e tradu√ß√£o? A diferen√ßa √© a abrang√™ncia da nova medida. Quando se trata de um s√≠tio operador, um RBS, um RNAm e o pr√≥prio gene sendo “lido”, n√£o h√° diferen√ßa alguma em se medir uma taxa de transcri√ß√£o e o “PoPS” ou uma taxa de tradu√ß√£o e o “RiPS”. Mas faz sentido se medir a taxa de transcri√ß√£o de um s√≠tio terminador por exemplo!? Esse elemento de DNA, que teoricamente n√£o √© transcrito (√© ele quem justamente para a transcri√ß√£o), ainda pode eventualmente ter um “leak” e permitir a passagem de uma polimerase. Usar a express√£o “… a taxa de transcri√ß√£o de um s√≠tio terminador …” n√£o faz sentido nenhum, mas acontece. Se usarmos PoPS, que por defini√ß√£o √© o n√ļmero de vezes que uma RNA polimerase passa por um ponto espec√≠fico de uma mol√©cula de DNA por unidade de tempo, ainda h√° sentido, pois nessa defini√ß√£o n√£o importa qual a regi√£o do DNA a Polimerase passa. √Č esse tipo de generalidade que permite o f√°cil uso e novas combina√ß√Ķes de dispositivos sint√©ticos.

Hierarquia de Abstração

Com a cria√ß√£o de sistemas f√°ceis de se integrar, os engenheiros biol√≥gicos podem se beneficiar de m√©todos largamente praticados em qualquer campo da engenharia, como a hierarquia de abstra√ß√£o. Com isso √© mais simples se lidar com a complexidade de sistemas biol√≥gicos quando se omite informa√ß√Ķes desnecess√°rias. Desse modo (ver imagem abaixo), algu√©m trabalhando no n√≠vel de abstra√ß√£o das partes biol√≥gicas n√£o precisa se preocupar com o design e s√≠ntese do DNA que usar√°, do mesmo modo, algu√©m trabalhando no n√≠vel sist√™mico precisa pensar em apenas quais dispositivos incluir e como conect√°-los para realizar uma fun√ß√£o desejada, sem precisar se preocupar com os outros n√≠veis de abstra√ß√£o.

Imagem retirada de: D. Baker, G. Church, J. Collins, D. Endy, J. Jacobson, J. Keasling, P. Modrich, C. Smolke, and R. Weiss. ENGINEERING LIFE: Building a FAB for biology. Scientific American, pages 44‚Äď51, June 2006.

Como medir PoPS?

A maioria dos sistemas criados e estudados hoje em dia em Biologia Sint√©tica envolve controle transcricional da atividade gen√©tica, o que faz do PoPS a vari√°vel mais difundida na √°rea, principalmente pelas pesquisas envolvendo l√≥gica booleana em sistemas gen√©ticos¬†(portanto n√£o √© muito comum encontrar “RiPS” em artigos por a√≠).
N√£o existe um m√©todo direto para se medir PoPS, mas √© poss√≠vel chegar em seu valor indiretamente atrav√©s de medi√ß√Ķes de fluoresc√™ncia de genes reporter. √Č poss√≠vel – se voc√™ puder encontrar os par√Ęmetros na literatura ou med√≠-los – encontrar o PoPS de um dispositivo em cinco passos:

Cinco Passos Para o PoPS

1. Ligação de um Gene Repórter como Output

Antes de mais nada, ser√° preciso de um fluor√≠metro (√© claro) e demum espectofot√īmetro para medir densidade celular. Como exemplo, vamos observar a parte BBa_F2620:

Esse BioBrick tem como “entrada” a subst√Ęncia de quorum sensing 3-oxohexanoil-homoserina lactona e tem como “sa√≠da” PoPS. Em presen√ßa de 3OC6HSL, o gene que produz o fator de transcri√ß√£o luxR promove a transcri√ß√£o de genes ap√≥s o Lux pR, na parte final do BioBrick BBa_F2620. Para mensurar o qu√£o ativo o luxpR fica, liga-se outro BioBrick no final do dispositivo para mudar o output do sistema colocando-se o BBa_E0240¬†–¬†a ORF (Open Reading Frame) do GFP (Green Fluorescent Protein):

Assim tem-se uma nova parte, o BioBrick BBa_T9002:

2. Medi√ß√£o da Fluoresc√™ncia e Absorb√Ęncia e Subtra√ß√£o do Background

Para medir a fluoresc√™ncia do GFP e a absorb√Ęncia da amostra de c√©lulas, √© preciso criar dois controles: um da absorb√Ęncia (A) e outro da fluoresc√™ncia (G). O controle da fluoresc√™ncia ser√° o pr√≥prio BBa_T9002 sem ser induzido pela subst√Ęncia de quorum sensing (G_n√£o-induzido), enquanto o controle da absorb√Ęncia √© feita da maneira trivial, verificando somente a absorb√Ęncia do meio de cultura (A_background). Para se obter os reais valores de Fluoresc√™ncia induzida por 3OC6HSL e da densidade celular, basta ent√£o subtrair esses valores de background com os valores medidos durante a indu√ß√£o pela subst√Ęncia de quorum sensing:

3. Correlação com a Curva Padrão

Com as corre√ß√Ķes em m√£os, outro procedimento trivial a ser feito √© encontrar a curva padr√£o de fluoresc√™ncia versus GFP e de absorb√Ęncia versus n√ļmero de c√©lulas. Por exemplo, experimentos feitos em laborat√≥rio chegaram a essas retas de correla√ß√£o de valores:

Em que UFC √© “Unidade Formadora de Col√īnia” – o n√ļmero de c√©lulas na amostra. E “GFP” seria o n√ļmero de mol√©culas de GFP medidas.

4. Interpolar a Curva de GFP versus Tempo Obtida na Medição

A s√≠ntese total de GFP por c√©lula (S_c√©lula) √© dada pela taxa de produ√ß√£o de GFP total (S_total) dividida pelo n√ļmero de c√©lulas (UFC):

Para encontrar a derivada de [GFP] por tempo, basta plotar os dados de GFP obtidos por tempo e interpolar com uma função logística (provavelmente) para obter a equação que melhor descreve a variação de GFP no tempo.

5. Colocar os Valores Nessa Equação Aqui

Depois de determinada a função Scélula, basta colocá-la nessa fórmula e encontrar o PoPS:

Em que:
a = Taxa de maturação do GFP Р1/s
GammaM = Constante de degradação do RNA Р1/s
GammaI = Constante de degradação do GFP imaturo Р1/s
R√ī = Constante de s√≠ntese proteica por RNAm (RiPS) – [Prote√≠na]/[RNAm].s
PoPS = Polimerase por segundo – [mRNA]/[DNA].s

CUIDADO: Conte√ļdo Matem√°tico – Prossiga com Cuidado (Ou n√£o…)

Chega-se nessa express√£o atrav√©s de um pequeno sistema de equa√ß√Ķes diferenciais:

As equa√ß√Ķes expressam uma din√Ęmica simplificada de um sistema de transcri√ß√£o e tradu√ß√£o de uma informa√ß√£o gen√©tica. Para chegar na express√£o de PoPS, basta substituir a √ļltima equa√ß√£o na segunda e isolar M. Com a express√£o resultante, basta substituir a vari√°vel M na primeira equa√ß√£o e sua derivada em dM/dt.

ATEN√á√ÉO: Aqui acaba o conte√ļdo matem√°tico. Est√° tudo bem agora.

E essa √© a hist√≥ria de como voc√™ pode encontrar o PoPS – essa vari√°vel estranha! – no seu pr√≥prio laborat√≥rio (ou ao menos entender do que se trata). Assim como um circuito el√©trico, que pode ser montado da melhor maneira poss√≠vel e mesmo assim n√£o funcionar por raz√Ķes obscuras, sistemas biol√≥gicos t√™m muito mais esse problem√°tico costume de n√£o se comportar como esperado. Contudo essa abordagem mais generalista da atividade transcricional de uma c√©lula √© uma boa maneira de se tentar enfrentar o grande desafio de se deixar a biologia mais “engenheir√°vel” e mais “precisa”. N√£o que essa seja a coisa mais f√°cil do mundo, mas ela nunca ser√° se ningu√©m tentar. E estamos aos poucos conseguindo.

Referências: