Regeneração de colunas Miniprep Qiagen

Eu sempre achei um desperdício enorme jogar fora  as colunas presentes nos kits comerciais. Até que no ano passado, baseado em um protocolo simples e barato de Siddappa NP, publicado em 2007 na revista Biotechniques começamos a regenerar as colunas de extração de plasmídeo Miniprep Qiagen. Basicamente, as colunas são tratadas com 1 M de HCl durante a noite, lavadas repetidamente com água e reequilibradas com tampão EB ou TE.

Os autores do artigo estavam preocupados com a contaminação de DNA antigo nas colunas regeneradas e utilizaram RT-PCR e ensaios de transfecção para demonstrar que existe zero de contaminação nas colunas reutilizadas. Eles também demonstraram que a exposição prolongada a 1M de HCl não afeta a capacidade de ligação de DNA. Talvez seja apenas o prazer de usar uma coluna reutilizada, mas eu tenho a impressão que as colunas regeneradas funcionam melhor que as novas. Li em algum lugar que este protocolo funciona muito também para os Midi e MaxiPrep também.

O kit da Miniprep Qiagen com 50 reações custa cerca de R$350,00, dessa maneira, cada extração de plasmídeo custa cerca de 7 reais (contando apenas o custo de kit, sem contar eppendorfs, centrífuga, luz,…). Já utilizamos colunas regeneradas 5 vezes e queremos chegar até 10 regenerações, assim, poderemos realizar 50o extrações plasmidiais a cerca de R$o,35. Muito mais justo. O problema, agora, será a quantidade de buffers que você vai precisar. Mas não se preocupe, no final do artigo você vai encontrar os protocolos de tampões que podem ser utilizados no lugar dos comerciais (que acho que ainda podem ser otimizados).

Se alguém tiver outros protocolos para fazer render a verba, por favor, me avise!

Protocolo de regeneração das colunas de extração de DNA plasmidial:

1. Colocar em uma solução a 1N HCl por um dia (1 L para 100 colunas). Importante deixar as colunas imersas na solução sem bolhas dentro da coluna  (costumo sonicar por 5 min para retirar bolhas de ar);

2. Lavar repetidamente (4 – 5 vezes) as colunas com H2O destilada autoclavada.

3. Deixar secar a 37°C por 24h (acima desta temperatura as colunas estragam). Selar em plásticos e anotar no saco quantas vezes aquela coluna já foi utilizada. Manter em local seco.

4. Antes de utilizar, reequilibrar a coluna com 50 µL de TE a 42oC. Eu sempre faço a eluição do DNA a 42oC para aumentar o rendimento.

Soluções do kit Qiagen:

Buffer N3: 4.2 M Guanidina-HCl, 0.9 M potassium acetato,  pH 4.8

PS: já tentei o tampão de acetato de potássio do Birnborim (lise alcalina) mas não funcionou muito bem.

Buffer P1: 50mM Tris HCl pH, 10mM EDTA, 100µg/ml de RNase

Buffer P2: 200mM NaOH, 1% de SDS

Buffer PE: 10mM Tris HCl  pH 7,5, 80% etanol, 100 mM NaCl

PS: a concentração do sal me parece ser fundamental para uma boa eluição, eu tentei várias concentrações e com 100 mM obtive os melhores resultados.

Buffer EB (TE): 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0

Para mais detalhes, consulte o site do autor.

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