Calculadora para sítios de ligação com ribossomos (RBS)

RBSUm objetivo central da biologia sintética é programar células para desenvolver funções valiosas. À medida que se constroem sistemas genéticas maiores e mais complexos (como os de escala genômica), serão necessários modelos e técnicas para combinar as partes genéticas de maneira eficiente para se atingir um comportamento específico. Para isso, serão necessários modelos biofísicos que descrevam a relação de uma sequência de DNA que a sua função. Um passo muito importante nesse sentido foi dado pelo Grupo do Prof. Howard Salis, pesquisador que eu tenho o prazer de trabalhar dentro do Synberc, com o desenvolvimento da calculadora de RBS (ribossomal binding site ou sítio de ligação com o ribossomo). Engenharia genética de microrganismos é um processo tempo intensivo (por ex. o desenvolvimento de uma nova rota metabólica para a produção de um produto químico pode levar de 5 a 10 anos de P&D para chegar a etapa industrial) que normalmente requer múltiplas rodadas de tentativas e erro utilizando mutações aleatórias. À medida que se torna possível construir sistemas gênicos cada vez mais complexo (incluindo genomas completos), métodos automatizados para montagem desses sistemas e para otimização de vias metabólicas se tornam necessários para diminuir custos e tempo de desenvolvimento. Além disso, com o aumento da complexidade do sistema, a aplicação de métodos de tentativa e erro para sua otimização se torna cada mais difícil e ineficaz. Uma maneira de otimizar um sistema gênico é através da variação da sequencia de seus elementos regulatórios para controlar os níveis de expressão de suas proteínas codificadoras. Cada passo limitante na expressão de um gene oferece a oportunidade para modular racionalmente os níveis de expressão proteica. Em bactérias, sítios de ligação do ribossomo e outras sequencias regulatórias de RNA são elementos de controle eficientes para o início da tradução. Como consequência, essas sequências são comumente modificadas para a otimização de circuitos genéticos. Vias metabólicas e expressão de proteínas recombinantes. Assita um video bem interessante no Youtube sobre tradução. Não é mostrado no video (e não consegui encontrar um melhor) o RBS é uma sequencia do RNA que direciona o ribossomo para o start codon, ele complementar a região do rRNA 16S que é parte da subunidade pequena 30S do ribossomo. Basicamente, quando mais complementar o RBS é ao 16S rRNA, maior é a afinidade e maior é a taxa de tradução. Como foi descrito no video, a tradução em bactérias (procariotos) consiste em quatro fases: iniciação, elongamento, terminação e o turnover do ribossomo (na verdade, esta última fase não foi mostrada no video). Na maioria dos casos, o início da transcrição é o gargalo do processo inteiro. O taxa de iniciação de transcrição se dá pela combinação de diferentes efeitos moleculares: incluindo a hibridação do rRNA 16S com a sequencia do RBS, a ligação do tRNA formilmetionina ao start codon, a distância entre o síto de ligação do rRNA 16S e o start códon, e a presença de estruturas secundárias de RNA que podem obstruir o RBS ou o start codon. Para o otimização de expressão de genes, é muito comum o desenvolvimento de bibliotecas de sequencias de RBS com o objetivo de otimização de funções de sistemas gênicos. Porém, a construção e seleção de bibliotecas de sequências se torna impraticável com o aumento de proteínas no sistema. Por exemplo, para realizar mutações randômicas em 4 nucleotídeos para um RBS resulta em uma biblioteca de 256 sequencias. O tamanho da biblioteca aumenta combinatoriamente com o número de proteínas do sistema, ou seja, 16,7 milhões de sequências para um sistema com 3 proteínas e 2,8 x 1014 sequencias para um sistemas com 6 proteínas). Dessa maneira, se torna necessários processos mais racionais para avaliar sequencias de RBS. A calculadora de RBS utiliza um modelo estatístico termodinâmico para predizer a taxa de iniciação de tradução de uma proteína. Dado um RBS e a região codificadora da proteína, o modelo é capaz de calcular a mudança de energia livre durante a montagem do complexo ribossomal 30S no RNAm (ΔGTOT). Depois, o modelo estatístico é capaz de correlacionar a taxa de início de transcrição com o ΔGTOT. Dessa maneira, o modelo biofísico preenche uma lacuna de desenho racional de RBS, criando uma relação quantitativa entre um sequencia de letras (As, Gs, Cs e Us) e um número (taxa de iniciação de tradução). A calculadora de RBS, portanto, combina um modelo biofísico com otimização estocástica para identificar uma sequência sintética (não natural) de RBS que irá proporcionar a taxa de início de tradução desejada. É importante destacar que esta relação também depende dos 35 nucleotídeos iniciais da região codificadora da proteína e que o RBS sintético precisa ser desenhada com esta sequencia incluída. A calculadora de RBS está disponível do site do laboratório do Salis . E é muito simples de utilizar, basta criar uma conta de usuário, recortar e colar as sequências, e definir uma ou mais taxas de iniciação de transcrição. RBS calculator

Outras ferramentas para controle de transcrição também estão disponíveis como a Small RNA Calculator.

Bons experimentos!

Salis, H., Mirsky, E., & Voigt, C. (2009). Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression Nature Biotechnology, 27 (10), 946-950 DOI: 10.1038/nbt.1568

Computadores bacterianos

De acordo com o verbete da wikipedia, um computador é uma máquina programável desenhada para, automaticamente, realizar um sequência de operações aritiméticas ou lógicas. Um computador pode prover-se de inúmeros atributos, dentre eles armazenamento de dados, processamento de dados, cálculo em grande escala, desenho industrial, tratamento de imagens gráficas, realidade virtual, entretenimento e cultura. Os primeiros computadores analógicos surgiram no século XVII e eram capazes de realizar as funções básicas de somar, subtrair, multiplicar e dividir. Mas foi na II Guerra Mundial, em meados do século XX, que realmente nasceram os computadores atuais. A Marinha dos Estados Unidos, em conjunto com a Universidade de Harvard, desenvolveu o computador Harvard Mark I, projetado pelo professor Howard Aiken, com base no calculador analítico de Babbage. O Mark I ocupava 167m2 e pesada cerca de 30 tonelada aproximadamente, conseguindo multiplicar dois números de dez dígitos em três segundos.Seu funcionamente era parecido com uma calculadora simples de hoje em dia. Nem é preciso falar o quanto esta tecnologia se desenolveu até hoje, em que hoje se discuti processadores quânticos e se faz computação em nuvem. Uma plataforma diferente das “baseadas no silício”, que estamos acostumados, são os biocomputadores. Em 1994, em um experimento muito elegante, Leonard Adleman desenvolveu o primeiro experimento envolvendo um computador de DNA para resolver o problema do Caminho Hamiltoniano: um problema que envolve caminhos hamiltonianos é o problema do caixeiro viajante, em que um caixeiro deseja visitar um conjunto de N cidades (vértices), passando por cada cidade exatamente uma vez, fazendo o caminho de menor tamanho possível (Figura 1).

 

Figura 1. O grafo em vermelho é hamiltoniano.

Cada bola é um nó e cada flecha é uma aresta. Existem multiplas possibilidades de construir um computador baseado em DNA, em que cada um possui suas vantagens e desvantagens. A maioria deles funciona utilizando as portas lógicas (AND, OR, NOT) associadas a lógica digital utilizando como base o DNA, como por exemplo, o contador bacteriano . Porém os primeiros computadores moleculares baseados em DNA, são reações in vitro utilizando, por exemplo, enzimas de restrição, ligases, e DNA (Benenson et al. 2001). Através da mistura desse componentes e reações em cascada de digestão, ligação e hibridização, o output final é uma molécula detectável que representa o resultado computacional. Em 1994, Leonard Aldleman foi capaz desenvolver um computador in vitro baseado em DNA para solucionar o problema do Caminho Hamiltoniano (Figura 1), porém apenas em 2009, Baumgardner e colaboradores conseguiram resolver um problema complexo in vivo, em E. coli. Porém, para entender, é necessário uma série de abstrações para tornar sequências de DNA em vértices e arestas de um caminho hamiltoniano (ver Figura 2). A primeira abstração trata segmentos de DNA como as arestas de um determinado grafo. As arestas de DNA são flanqueados por sítios hixC que podem ser embaralhados por um recombinase Hin, criando diversas ordens e orientações randômicas para as arestas do grafo. A segunda abstração está relacionada com os nós, com exceção do nó terminal, em que um nó é um gene divido ao meio por uma sequência hixC. Os autores conseguiram construir enzimas funcionais portando essas sequências codificadas no DNA. Dessa maneira, a primeira metade (5´) de um nó é encontrada na aresta de DNA que termina em um nó, enquanto a segunda metade (3´) do gene é encontrado em uma aresta de DNA que se origina no nó. Calma, realmente não é fácil entender, é preciso pensar e abstrair, veja a figura 2.


Figura 2. Construção de DNA que codificam um problema do Caminho Hamiltoniano com três nós. a. O grafo contendo o caminho Hamiltoniando começa no nó RFP, procedendo para o nó GFP e terminando no nó TT. b. Construção ABC representam a solução para o problema dos três nós. Os três fragmentos de DNA flanqueado por hixC estão na ordem e orientação corretas, de maneira que os genes GFP e RFP estão intactos. ACB possui o gene RFP intacto, porém o gene GFP está errado, por fim, a construção BAC não possue nenhum gene intacto.

A Figura 2a mostra o grafo com os 3 nós e as 3 arestas que foram escolhidas para serem codificados no computador bacteriano. O gráfico contêm um único caminho hamiltoniano que começa no nó RFP, viajando pela aresta A até o nó GFP, e utilizando a aresta B até alcançar o nó final TT. A aresta C, the RFP até TT é um detrator. A Figura 2b ilustra como as construções de DNA foram utilizadas para solucionar o problema do Caminho Hamiltoniano com um controle positivo e duas configurações sem soluções. Já que as soluções precisam originar no nó RFP e terminar no nó GFP, a aresta A de DNA contêm na extremidade 3´a metade de RFP seguida por a extremidade 5´de GFP. A aresta B de DNA se origina em GFP e termina em TT, dessa maneira, esse fragmento de DNA possui 3´GFP seguido de um terminado de transcrição duplo. A aresta C se origina em uma metade 3´ de RFP e termina em TT. Finalmente, com os genes codificadores para RFP e GFP estão intactos, com promotores e RBS, e seguintes de um terminador de transcripção, colônias ABC expressam fluorescência vermelha e verde, dessa maneira, possuem aparência amarela.

Para concluir a abstração eu gosto de imaginar que a recombinase Hin é o caxeiro viajante que faz o seu caminho pelo DNA e a sequência de DNA contem o mapa do caminho realixado.

A programação de bacteria para computar soluções de problemas complexos podem oferecer as mesmas vantagens dos computadores atuais que estamos acostumados, porém, com as seguintes características adicionais: (i) sistemas bacterianos são autônomos, eliminando a necessidade de intervenção humana, (ii) computadores bacterianos podem se adaptar a condições flutuantes, evoluindo para resolver desafios de determinados problemas e (iii) o crescimento exponencial de bactérias continuamente aumente o número de processadores trabalhando em um problema (Baumgardner et al., 2009). Sem contar que eles ainda poderiam fazer fotossíntese…

Adleman LM: Molecular computation of solutions to combinatorial problems. Science 1994, 266:1021-1024.

Benenson Y, Paz-Elizur T, Adar R, Keinan E, Livneh Z, Shapiro E: Programmable and autonomous computing machine made of biomolecules. Nature 2001, 414:430-434.

Baumgardner , J et al. Solving a Hamiltonian Path Problem with a bacterial computer. J. Biol. Eng. 2009, 24;3:11.

Lâmpada verde da Philips produz luz com bactérias

A Philips lançou uma lâmpada que utiliza bactéria bioluminescentes. Mais interessante é que esses microrganismos se alimentam de metano produzido pela compostagem de restos de alimentos realizado em pequena escala na própria casa. Para a Philips esse é o primeiro passo para a utilização de microrganismos em sistemas de iluminação.

Veja a matéria na íntegra.

As 50 empresas mais quentes de bioenergia

Acabou de sair um ranking de empresas que reconhece a inovação e os avanços em  bioenergia. Entre as 50, 37 são dos EUA, 15 são ativas no desenvolvimento do etanol celulósico, 5 desenvolvem algas para soluções energéticas e 16 produzem novos biocombustíveis avançados como o biobutanol,  biodiesel, gasolina e combustíveis de jato renováveis.

Veja a reportagem completa:

The 50 Hottest Companies in Bioenergy for 2010-11

The 50 Hottest Companies in Bioenergy for 2010-11 are:

Last year’s rank (2009-10)

1.            Amyris                              3

2.            Solazyme                          1

3.           POET                                 2

4.            LS9                                    8

5.            Gevo                                 13

6.            DuPont Danisco            7

7.            Novozymes                       11

8.             Coskata                             6

9.             Codexis                            35

10.            Sapphire Energy            5

11.             Virent                              21

12.             Mascoma                        10

13.             Ceres                                28

14.             Cobalt Technologies     30

15.             Honeywell’s UOP           12

16.             Enerkem                          25

17.             BP Biofuels                        4

18.             Genencor                         26

19.             Petrobras                          18

20.             Abengoa Energy             15

21.             Qteros                                22

22.             Joule Unlimited              32

23.             Shell                                    27

24.             Bluefire Renewables        19

25.             Rentech                              38

26.             Algenol                                24

27.             ZeaChem                             20

28.             PetroAlgae                          16

29.             Neste                                    29

30.             Synthetic Genomics           17

31.             LanzaTech                            41

32.             Iogen                                    23

33.             OriginOil                             42

34.             RangeFuels                         14

35.             ExxonMobil                        29

36.             Cargill                                    NR

37.             SG Biofuels                          49

38.             Butamax                              38

39.             Terrabon                              47

40.             Cosan                                    NR

41.             Verenium                              9

42.             Waste Management            42

43.             IneosBio                                36

44.             Dynamic Fuels                     NR

45.             Fulcrum Bioenergy              48

46.             KL Energy                             34

47.            KiOR                                       NR

48.             Chevron                                 NR

49.             Monsanto                              NR

50.             Inbicon                                    50

Bio-Fiction videos – Please rate your favourite videos!

Vejam os vídeos do Synthetic Biology Science, Art and Film Festival que ocorreu em Viena nos dias  14 a 16 de maio!

Votem nos melhores vídeos numa escala de 1 a 5:

http://bio-fiction.com/videos/

Produção de biodiesel por bactérias

ResearchBlogging.org

Imagine uma plantação enorme de soja no interior do Mato Grosso e uma instalação para a extração do óleo de soja, que é composto por vários ácidos graxos. Agora imagine no interior de São Paulo, uma grande usina de etanol cercada por dezenas de quilômetros por cana-de-açúcar. Imagine o etanol e óleo de soja sendo transportados até uma usina de biodiesel para, utilizando um catalisador (normalmente hidróxido de sódio), serem esterificados em um éster (biodiesel) e em glicerina. Muito trabalho e muito recurso para produzir um biocombustível não acham?

Recentemente, um trabalho muito interessante foi publicado pelo Jbei Instute demonstrando a possibilidade de se utilizar uma bactéria para produzir biodiesel em apenas uma etapa, e ainda por cima, utilizando resíduos agroindustriais, como por exemplo, o bagaço de cana-de-açúcar. Essa bactéria modificada geneticamente é capaz de produzir ácidos graxos e etanol e enzimaticamente realizar a esterificação desses produtos em biodiesel. Bacana não é? Os detalhes da pesquisa serão descritos a seguir.

Ácidos graxos têm sido utilizados há séculos para a produção de combustíveis e produtos químicos, incluindo o biodiesel, surfactantes, solventes e lubrificantes. Porém a demanda crescente e a produção limitada de óleos vegetais têm causado questionamentos sobre o aumento dos preços dos alimentos, sobre a prática de utilização dos solos e os aspectos socioambientais relacionados com a sua produção. Uma alternativa é a produção desses derivados de ácidos graxos via conversão biológica utilizando microrganismos como levedura e bactérias. Dentro desses produtos, os etil-ésteres de ácidos graxos (o famoso biodiesel) têm despertado muito interesse. Só para ilustrar, a demanda mundial de diesel vem crescendo três vezes mais que a de gasolina.

Ácidos graxos são produzidos naturalmente por microrganismos, eles compõem, entre outras coisas, a membrana celular. Porém, Jay Keasling e seu grupo construíram uma E. coli geneticamente modificada capaz de produzir ácidos graxos livres (através da expressão de uma tioesterase citoplasmática e da deleção de genes responsáveis pela degradação de ácidos graxos) e etanol (expressando os genes de Zymomonas mobilis). Além disso, foi clonada uma enzima (Acr1) capaz de realizar a transesterificação em bioedisel, sendo que que a glicerina produzida é reabsorvida pela bactéria para a produção de mais biodiesel.

O tamanho e a saturação do ácido graxo influenciam diretamente nas propriedades químicas do biodiesel, como temperatura de fusão. Alguns trabalhos têm demonstrado que,
através da expressão de tioesterases de plantas, é possível produzir ácidos graxos sob medida para diferentes aplicações. Essa ferramenta genética possibilita a produção de biodiesel com composições definidas, dessa maneira, com performance e características desenvolvidas sob medida.

Por fim, essas bactérias foram modificadas para utilizar matérias-primas de baixo custo, como a hemicelulose presente no bagaço de cana-de-açúcar. É uma pesquisa pioneira que mostra bem o tipo de engenharia sistêmica de metabolismo microbiano que vem sido feita. Através de várias modificações genéticas foi possível aumentar a produção de 40 mg/l para quase 700 mg/l de biodiesel. Resultado este ainda baixo para se cogitar uma aplicação a curto-prazo, mas, sem sombra de dúvida, as perspectivas são muito animadoras.

Steen EJ, Kang Y, Bokinsky G, Hu Z, Schirmer A, McClure A, Del Cardayre SB, & Keasling JD (2010). Microbial production of fatty-acid-derived fuels and chemicals from plant biomass. Nature, 463 (7280), 559-62 PMID: 20111002

O que é Biologia Sintética?

Este post deveria ser um dos primeiros artigos para um site que se diz especializado em biologia sintética. Mas confesso para vocês que definir o que é biologia sintética, para mim, não foi (é) uma tarefa fácil. Como podem ser vistos nos posts no blog, existem vários aspectos da synbio que permitem diferentes definições de acordo com o ponto de vista de quem está fazendo biologia sintética. Por exemplo, um engenheiro interessado em criar dispositivos computacionais sintéticos em uma bactéria, ou um biotecnólogo interessado em produzir biocombustíveis ou um biólogo querendo montar uma bactéria a partir de simples elementos químicos. Claramente, todas estas áreas estão conectadas, mas criar uma definição que consiga embarcar todas as possibilidades não é trivial. Por isso, digo que este post é orgânico, que deve mudar à medida que o meu conhecimento sobre o assunto se aprofunda.

Uma característica que une todos os biológos sintéticos é a vontade de tornar o processo de engenharia de sistemas biológicos mais fácil e confiável. Dentro desse contexto, existem quatro diferentes níveis de atuação da biologia sintética:

(i) partes biológicas: sendo o DNA a linguagem de programação, as partes biológicas são uma sequência de dados (AGCTA…) que possuem funções determinadas. Por exemplo, uma sequência de DNA que faz a célula mudar a cor de verde para amarelo. Estas partes são descritas, catalogadas e respeitam determinado padrão físico de montagem (leia mais sobre os biobricks). Espera-se que com o tempo se possam descrever as características de inúmeras partes biológicas para serem utilizadas para a construção de dispositivos, sistemas,…. Essa é uma das funções da Secretária de Partes Biológicas Padrão do MIT.

(ii) dispositivos sintéticos: são compostos por partes biológicas capazes de processar sinais. Processam inputs em outputs. Para a construção de dispositivos robustos e eficientes são necessárias partes que funcionem de uma maneira previsível. Veja mais sobre dispositivos sintéticos.

(iii) sistemas sintéticos: são um conjunto dispositivos capazes de captar sinais, processar informações e realizar funções determinadas, como por exemplo, uma célula capaz de captar algum sinal do ambiente e decidir se irá realizar uma determinada função como combater uma célula tumoral, produzir determinado metabólito etc.

(iv) por útimo, existe a arquitetura sintética de populações em que, por ex, cada microrganismo possui um dispositivo diferente, sendo necessário que estes dispositivos trabalhem em conjunto para realizar determinada função. Trabalhar em conjunto, como uma população que precisa trabalhar com sincronismo, é o caso dos osciladores. Para isso, é necessário dominar mecanismos robustos de comunicação célula-célula.

A biologia sintética pode ser aplicada em praticamente todas áreas da biologia molecular, biotecnologia e engenharia genética. Porém existem algumas áreas que se destacam como sendo próprias da biologia sintética:

1. Construção de uma célula mínima: identificação das partes básicas para construção de uma célula.

2.  Reconstrução de células: tendo como objetivo central a construção de formas de vida artificiais a partir de elementos químicos.

3. Construção de novos códigos genéticos.

5. Construção de células capazes de realizar funções diferentes daquelas encontradas na natureza, como a obtenção de novas rotas bioquímicas de produção de novos compostos. .

Essa última, talvez seja a que mais tenha impacto nas nossas vidas cotidianas a curto-prazo, através do desenvolvimento de remédios mais baratos e com a produção de combustíveis e químicos utilizando recursos renováveis.

Secretaria de Partes Biológicas Padrão

Já comentei em posts anteriores sobre os Biobricks, as partes biológicas padrão da biologia sintética. Dentro desse contexto, foi fundado em 2003, no MIT, a Secretaria de Partes Biológicas Padrão (Registry of Standard Biological Parts) para depositar as partes genéticas utilizadas na montagem de dispositivos e sistemas sintéticos. A secretaria contém mais de 3400 partes que podem ser trocadas por inúmeros laboratórios cadastrados e espera-se que todos contribuam com dados e novas partes para melhorar o repositório.

A secretaria oferece muitos tipos de partes biológicas, incluindo plasmídeos, primers, promotores, domínios de proteínas, sítios de ligação de ribossomos, riborreguladores, genes repórteres e etc… (veja a lista).

Entre os objetivos de criação do Registro estão: (i) possibilitar a engenharia sistemática da biologia, (ii) promover o desenvolvimento transparente e aberto de ferramentas de engenharia biológica e (iii) para construir uma sociedade que, produtivamente e democraticamente, possa aplicar tecnologias biológicas.

Atualmente mais de 120 laboratórios do mundo inteiro pertencem à comunidade dos Biobricks. Este ano, o Laboratório de Bioprodutos da USP foi o primeiro laboratório do país a fazer parte dessa comunidade. Algumas das nossas construções genéticas já  estão sendo feitas em formato biobrick para que possamos receber partes e contribuir com partes também. Na próxima segunda, receberemos uma das responsáveis pela Secretária, Meagan Lizarazo que irá dar uma palestra sobre biologia sintética, biobricks, iGEM e outros assuntos relacionados.

Não percam esta oportunidade!

Palestra de pesquisadora do MIT sobre biologia sintética

Nesta segunda-feira, às 10:00 no anfiteatro 2 do ICBII (no centro didático anexo) teremos o grande prazer de receber a pesquisadora do MIT Meagan Lizarazo, que falará sobre Biologia Sintética, iGEM, Registro de Partes Padrão e outras coisas interessantes.

Não percam!

4.a reunião do synbiobrasil: processamento de sinais

Está confirmada a nossa próxima reunião, dia 24/03/2011 às  3 pm na sala 101 do ICBII. O tema será Processamento de sinais e se iniciará com uma palestra dos Prof. Vitor do Nascimento e Prof. Cássio Lopes do Departamento de Engenharia Elétrica da Poli. Será discutido um pouco de estimação e sistemas dinâmicos e pretende-se fazer um paralelo com o que já foi discutido sobre biologia sintética.

Até lá!