Mais um acidente a favor do pesquisador

Em 1986, o pesquisador Richard Jorgensen estava trabalhando com pet√ļnias quando aconteceu um acidente. Jorgensen desejava criar uma pet√ļnia roxa, por√©m muito mais roxa do que o normal. Para alterar a cor, ele procurou super-expressar a enzima chalcona-sintase (CHS) introduzindo um gene quim√©rico de CHS, uma enzima limitante da via respons√°vel pela colora√ß√£o das flores [1]. Mas a altera√ß√£o gen√©tica realizada teve um resultado totalmente inesperado e grande parte das p√©talas se tornaram brancas e n√£o roxo escuro como ele desejava.

O mist√©rio s√≥ foi desvendado em 1998 e conferiu o Pr√™mio Nobel a dois pesquisadores americanos, gerou especula√ß√Ķes sobre a cura de dezenas de doen√ßas e mais recentemente se tornou uma nova ferramenta para a biologia sint√©tica.¬†Andrew Fire e Craig Mello descobriram que Jorgensen havia esbarrado no que eles vieram a chamar de RNA de interfer√™ncia (RNAi), um mecanismo de silenciamento g√™nico.

O gatilho para o mecanismo de silenciamento gênico por RNAi ocorre quando um RNA de dupla fita (dsRNA) se forma. Ao ser identificado um dsRNA, a enzima Dicer corta o dsRNA em fragmentos menores que se ligam ao complexo protéico RISC (RNA-induced silencing complex). Em seguida, apenas uma das fitas de RNA permanece presa ao complexo, que serve para ir em busca de fitas de mRNA que sejam complementares [2]. Quando um mRNA complementar é detectado, ocorre o pareamento com o RNA preso ao complexo e ele é então clivado e degradado. Como o mRNA não pode ser traduzido, o gene tem sua expressão reduzida (Figura 1). O silenciamento é uma poderosa ferramenta que agora encontrou uma aplicação na biologia sintética, por meio da evolução dirigida.

O sonho da biologia sint√©tica de construir sistemas que funcionem de modo previs√≠vel e robusto frequentemente entra em conflito com a complexidade dos sistemas biol√≥gicos. Al√©m de sua complexidade, o comportamento dos microrganismos dependem de um contexto, o que tamb√©m dificulta o uso de partes padronizadas [3]. Logo, m√©todos de evolu√ß√£o dirigida possuem grande utilidade, j√° que em princ√≠pio dispensam informa√ß√Ķes detalhadas de estrutura, funcionalidade e de mecanismos de um sistema [4].

 

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Figura 1: Mecanismo do RNAi – Imagem retirada de: http://pt.wikipedia.org/wiki/RNA_interferente

 

 

Um dos primeiros experimentos sobre evolu√ß√£o realizado em laborat√≥rio foi feito por¬† William Dallinger, em 1880. Dallinger conseguiu que seus microrganismos que cresciam a 18¬ļC passassem a crescer a 70¬ļC, no entanto o experimento levou 7 anos e envolveu¬† aumentar a temperatura de sua incubadora gradualmente at√© que eles fossem capazes de sobreviver. Hoje existem diversos m√©todos de evolu√ß√£o dirigida e um pouco menos demorados, entre eles o RAGE ‚Äď RNAi assisted genome evolution.

RAGE √© um m√©todo utilizado em Saccharomyces cerevisiae e √© bastante √ļtil quando se deseja obter fen√≥tipos complexos. Fen√≥tipos complexos, como a toler√Ęncia ao √°cido ac√©tico, dependem da altera√ß√£o de m√ļltiplos genes e s√£o de grande interesse para a ind√ļstria na produ√ß√£o de combust√≠veis e outros compostos qu√≠micos. O uso dessa t√©cnica reduz a express√£o de genes (knockdown) em escala gen√īmica e possibilita identificar genes que at√© ent√£o n√£o se imaginava terem papel em determinadas fun√ß√Ķes.

Para que tais genes possam ser identificados, √© necess√°rio criar uma biblioteca de RNAi. A biblioteca √© criada fragmentando o DNA gen√īmico com uma enzima de restri√ß√£o e clonando os fragmentos em um plasm√≠deo com promotores convergentes, necess√°rio para que RNAs de fita dupla sejam formados. Como S. cerevisiae n√£o possui a via de RNAi, tamb√©m √© necess√°rio inseri-la [6].

Via inserida e biblioteca criada o processo de evolução pode começar. Quando o knockdown de um gene for promissor, tal gene pode ser integrado e novos ciclos de transformação e screening podem ser feitos repetidamente (Figura 2), até que seu objetivo seja alcançado, ou pelo menos, chegue próximo dele.

 

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Figura 2: Evolução dirigida pelo método RAGE РImagem retirada de: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/sb500074a

 

Em 2006, Fire e Melo ganharam o Pr√™mio Nobel em fisiologia ou medicina por desvendarem o fen√īmeno observado por Jorgensen. Muitas descobertas acidentais fazem parte da hist√≥ria da ci√™ncia, como a penicilina, o raio X e o microondas, por exemplo. O m√©todo de evolu√ß√£o dirigida utilizando RNAi pode tamb√©m em breve facilitar a vida de muitos pesquisadores que buscam aprimorar seus microrganismos.

 

 

Referências

  1. NAPOLI, C.; LEMIEUX C.; JORGENSEN R. lntroduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. The Plant Cell, Vol. 2, p. 279-289.
  1. CLARK D. P. Molecular Biology. Vol. 2, chapter 11 (2010)
  1. DOUGHERTY, M. J.; ARNOLD, F. H. Directed evolution: new parts and optimized function. Current Opinion in Biotechnology, 2009, 20:1‚Äď6
  1. COBB, R. E; SUN,N.; ZHAO H. Directed evolution as a powerful synthetic biology tool. Methods (2012)
  1. SI, T.; LUOZ, Y.; BAO, Z.; ZHAO, H. RNAi-Assisted Genome Evolution in Saccharomyces cerevisiae for Complex Phenotype Engineering. ACS Synth. Biol. (2014)