BioBricks: fabricação de uma parte padrão.

At√© agora comentamos sobre a possibilidade de juntar diferentes componentes utilizando o padr√£o t√©cnico de montagem dos BioBricks. Mas neste post vou comentar sobre a fabrica√ß√£o de uma parte padr√£o. No futuro, eu¬†pretendo comentar sobre a s√≠ntese de DNA sint√©tico, mas agora¬†vou explicar como montar um BioBrick utilizando o m√©todo de PCR. O aparelho para realizar um PCR, o termociclador,¬†est√°¬†presente na maioria dos laborat√≥rios de biologia molecular, e hoje se apresenta como uma ferramenta b√°sica para este tipo de atividade. Existem centenas de livros e sites na Internet que podem te familiarizar com a t√©cnica. Primeiramente, um BioBrick¬†pode ser constru√≠do via PCR se existe algum molde de DNA do qual o BioBrick¬†possa ser amplificado (por ex., um gene de alguma bact√©ria)¬†ou se a parte √© pequena o suficiente que possa ser criada atrav√©s do alinhamento e extens√£o do primer (iniciador). Nos dois casos √© necess√°rio adicionar na extremidade 5′ dos primers as sequ√™ncias referentes aos s√≠tios das enzimas de restri√ß√£o presentes nos BioBricks, os sufixos e prefixos (ver post anterior).

A constru√ß√£o de BioBricks contendo sequ√™ncias codificadoras de prote√≠nas requer um sufixo e um prefixo um pouco mais especializados por duas raz√Ķes:

1. o prefixo é alterado para garantir o espaçamento entre o sítio de ligação do ribossomo e o códon ATG de início.

2. BioBricks que codificam proteínas possuem, por padronização, dois códons de sequência TAA de parada.

Ao¬†construir os primers, basicamente, √© necess√°rio “copiar e colar” a seguinte sequ√™ncia de¬†31 bp¬†no fim 5′ no seu primer upstream (ou iniciador universal) desenhado para o seu fragmento de DNA de interesse:

5′ —> 3′
GTT TCT TCG AAT TCG CGG CCG CTT CTA G ATG…
start codon (no caso de um gene)
E “copiar e colar” os seguintes 35 bp no fim 5′ do seu primer downstream (iniciador reverso):

5′ —> 3′
GTT TCT TCC TGC AGC GGC CGC TAC TAG TA TTA TAA….
duplo stop codon!

A estas sequências deve-se somar aproximadamente 20 bp de sequência de primer relativa a região codificadora. Para este tipo de clonagem se utiliza uma Taq polimerase com alta fidelidade e um kit de clonagem TOPO-TA cloning.

Claro que todas as outras precau√ß√Ķes para se desenhar um primer ainda s√£o v√°lidas, como a verifica√ß√£o de s√≠tios de restri√ß√£o nas sequ√™ncias. Para mais detalhes, veja o protocolo disponibilizado para a fabrica√ß√£o de BioBricks.