Brasil no iGEM

Para quem acha, n√£o somos o primeiro grupo a ambicionar ir a um evento do iGEM. L√° pelos idos de 2009 o Brasil participou pela primeira vez da competi√ß√£o representado pela Unicamp, conseguindo trazer aqui para o lado de baixo do hemisf√©rio uma medalha de ouro j√° “de cara”, equiparando-se √†s universidades mais renomadas do mundo, como Cambridge, Harvard e outras.

Sob o projeto intitulado “Microguards”, o time brasileiro criou um mecanismo de transforma√ß√£o de E.Coli’s e de leveduras¬† (S. Cerevisiae) em “micro guardas”, que atacam bact√©rias contaminantes de biorreatores de etanol, no caso as bact√©rias do g√™nero Lactobacillus (do tipo daquelas que regulam a sua a√ß√£o intestinal quando voc√™ bebe o seu leite fermentado – Yakult, Chamyto, e etc -). Usar um mecanismo como esse na ind√ļstria brasileira evitaria o atual desperd√≠cio de milhares de litros de √°lcool que deixam de ser produzidos por causa do a√ß√ļcar consumido pelos microorganismos invasores nos bioreatores de etanol. Cerca de 5 √† 10 % da produ√ß√£o √© desperdi√ßada por causa desses ladr√Ķezinhos.

O Mecanismo

Reconhecimento

“ColiGuards”

Criando uma esp√©cie de “sistema imune de bioreatores”, duas linhagens de E.coli’s s√£o criadas no meio de cultivo: a linhagem natural chamada de workers linage e a linhagem de “microguards”, ou killers linage; a popula√ß√£o dos dois tipos de linhagem varia dependendo do grau de contamina√ß√£o do meio, ou seja, quando n√£o h√° contaminantes, muito poucas bact√©rias workers transformam-se em killers e vice-versa.

A transforma√ß√£o em killers √© ativada por, um metab√≥lito secund√°rio de quorum sensing, AI-2 (se quiser saber mais clique aqui),¬† que √© liberado tanto pela bact√©ria contaminante quanto pelas E.Coli’s selvagens, √© reconhecido pelas E.Coli workers, que n√£o produzem AI-2, o que as induz a diferenciarem-se em killers. Al√©m disso elas podem detectar os contaminates atrav√©s da conjuga√ß√£o bacteriana¬†com os microorganismos invasores, abilidade que s√≥ as killers passam a ter no processo de diferencia√ß√£o, utilizando-a apenas naqueles microorganismos que possuem um plasm√≠deo diferente do seu (veja “recognition by conjugation” aqui).

“YeastGuards”

Para as Leveduras o mecanismo de reconhecimento da presen√ßa de contaminantes √© um pouco mais simples: a produ√ß√£o de lactato provinda do consumo de a√ß√ļcar dos Lactobacillus √© utilizada para ativar gatilhos g√™nicos – o que somente √© poss√≠vel atrav√©s da sensibiliza√ß√£o das leveduras ao lactato, utilizando uma permease expressa pela levedura para facilitar sua incorpora√ß√£o √† c√©lula – que induzem um ataque aos contaminantes.

Diferenciação

Os brasileiros aproveitaram o elegante design feito pelo time franc√™s da universidade de Paris no iGEM de 2007 para cria√ß√£o de um sistema de diferencia√ß√£o das E.Coli’s em microguards. Com a atua√ß√£o de uma recombinase (a cre recombinase),¬† parte dos genes do plasm√≠deo que transforma o microorganismo sofre excis√£o, tornando-se um pequeno peda√ßo de DNA circular com baixa taxa de atividade e sem origem de replica√ß√£o, enquanto os outros genes que permaneceram no plasm√≠deo passam a se tornar ativos devido ao seu reposicionamento na fita de DNA logo ap√≥s um promotor, como pode ser visto na imagem logo abaixo:

Lox71 e lox66 s√£o os s√≠tios do DNA onde atuam as cre recombinases (atua√ß√£o simbolizada pelo raio vermelho). Ap√≥s sua a√ß√£o, os genes ap√≥s as regi√Ķes de termina√ß√£o (T) s√£o reposicionados - no caso do exemplo o gene dapA - pr√≥ximos ao promotor que antes era da regi√£o excisionada (na imagem o promotor Tet), e por isso tornam-se ativos.

O controle populacional dos microorganismos killers √© mantido atrav√©s do gene ftsK da imagem acima: um gene que produz uma prote√≠na determinante na divis√£o celular, sendo uma “m√°quina literal de segrega√ß√£o de cromossomos”.¬†Dessa maneira, evita-se que a popula√ß√£o de killers cres√ßa demais e se torne um “tiro pela culatra”, diminuindo a produ√ß√£o de etanol.

Outro aspecto bastante interessante da constru√ß√£o das ColiGuards √© o mecanismo de controle de uma popula√ß√£o basal de killers em um biorreator n√£o contaminado. Eles usaram uma criativa constru√ß√£o feita por outro time do iGEM, o de Caltech de 2008, que se aproveitou de uma “falha” da atividade da DNA-polimerase para randomizar a express√£o de um gene em uma popula√ß√£o bacteriana. Essa “falha” √© a caracter√≠stica que a polimerase possui de ignorar ou repetir algumas sequ√™ncias de nucleot√≠deos que s√£o repetidas longamente no c√≥digo, produzindo uma c√≥pia de DNA com um n√ļmero vari√°vel dessas repeti√ß√Ķes (fen√īmeno chamado de SSM, do ingl√™s: slipped-strand mispairing), a consequ√™ncia disso √© que a sequ√™ncia codificadora (o gene) pode ser deslocada da posi√ß√£o correta em rela√ß√£o ao seu start codon se as repeti√ß√Ķes n√£o forem m√ļltiplas de 3 (porque cada c√≥don √© constitu√≠do de 3 nucleot√≠deos), e assim a tradu√ß√£o n√£o √© feita corretamente. Veja figura abaixo:

As letras mai√ļsculas correspondem cada uma a um amino√°cido, traduzido por um c√≥don (grupo de tr√™s nucleot√≠deos). ATG √© o start codon e TAA √© um codon de parada formado pelo deslocamento da sequ√™ncia codificadora. Repare que ap√≥s uma SSM, uma repeti√ß√£o foi omitida.

Assim, as replica√ß√Ķes de DNA que tiverem as repeti√ß√Ķes m√ļltiplas ATGC m√ļltiplas de tr√™s, ter√£o o ajuste correto da regi√£o codificadora em rela√ß√£o ao start c√≥don e a tradu√ß√£o correta da cre recombinase ser√° poss√≠vel:

Alguns tipos de Slipped Strand Mutation que podem acontecer na população de E.Coli's.

Como esse tipo de erro da DNA-polimerase n√£o √© t√£o frequente, apenas uma pequena parte da popula√ß√£o se diferenciar√° em killer se as repeti√ß√Ķes forem colocadas antes do gene da cre recombinase.

Para diferenciar bactérias workers na vizinhança de contaminantes, todos os microguards possuem uma outra cópia do gene recombinase, mas controlado por um promotor sensível ao AI2 liberado pelos Lactobacillus e pelas Coliguards quando detectam a presença dos invasores (figura ao lado).

Mecanismo de Ataque

Os mecanismos de ataque aos contaminantes que os Microguards possuem s√£o divididos em tr√™s tipos: a¬†libera√ß√£o de subst√Ęncias nocivas ao¬† Lactobacillus, a conjuga√ß√£o de um plasm√≠deo contendo genes que provocam a morte celular do invasor, e a estrat√©gia kamikaze: quando se libera uma grande quantidade de subst√Ęncias que s√£o nocivas ao Lactobacillus e levam o microorganismo √† lise (ver figura abaixo). A Yeastguard possui em seu arsenal somente o primeiro mecanismo, enquanto a Coliguard disp√Ķe dos tr√™s no combate aos invasores. Essa desigualdade beligerante entre os dois microorganismos, segundo o pr√≥prio grupo (veja a parte dois do v√≠deo no final do post), n√£o foi uma discrimina√ß√£o proposital √†s Leveduras: se deu mais √† falta de tempo para implantar e documentar a maquinaria funcionando nas Leveduras at√© o congelamento da wiki do grupo. Competi√ß√Ķes t√™m dessas coisas!

A constru√ß√£o desses mecanismos de ataque aproveitou-se da maior diferen√ßa estrutural entre as E.coli’s e¬†Leveduras, e o Lactobacillus:¬† a coli √© uma bact√©ria Gram negativa (possui duas membranas celulares, existindo entre elas uma fina parede celular) e o invasor √© Gram positivo (possui apenas uma parede celular no exterior e uma membrana celular interior do compartimento celular), enquanto a parede celular das leveduras √© constitu√≠da de carbohidratos, diferentemente dos pept√≠deoglicanos¬†do contaminante. Sabendo disso, o grupo resolveu expressar subst√Ęncias que ataquem a parede celular de pept√≠deoglicanos exposta dos¬† Lactobacillus e encontraram as lisozimas como a arma perfeita para isso, sendo usadas tanto na secre√ß√£o como no m√©todo kamikaze.

O grande problema dos m√©todos de secre√ß√£o √© que eles podem se comportar como contaminantes, al√©m da consequente redu√ß√£o do grau de efetividade da enzima durante o tempo devido √† sele√ß√£o natural. A solu√ß√£o encontrada para esse problema foi a conjuga√ß√£o de um plasm√≠deo (lembrando que somente as killers t√™m a abilidade de conjuga√ß√£o!) com o gene de uma endonuclease, a colicina, destruindo os Lactobacillus “por dentro”. Para que as pr√≥prias E.coli’s n√£o fossem afetadas por esse gene letal, foi inserido um gene de resist√™ncia que torna a express√£o de colicina inofensiva √†s Coliguards.

iGEM 2009

Melhor do que descrever como foi o projeto, nada melhor do que as próprias pessoas que participaram do evento para explicarem o que fizeram! Confira a apresentação do grupo brasileiro no Jamboree realizado em 2009 no MIT:

E nesse ano h√° outro time em associa√ß√£o com a universidade francesa de Saint-Etienne, com o projeto intitulado “Stress Wars”. Confira o que j√° est√° sendo feito nesse novo projeto franco-tupiniquim grupo junto aos outros links interessantes logo abaixo:

E a USP? Quando entrará nessa também!?
Aguardemos!