Switch de Luz Vermelha

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Os mecanismos de ativação da expressão gênica majoritariamente utilizados em biologia sintética hoje, que utilizam pulsos de algum tipo de metabólito para a indução de uma resposta gênica, possuem diversas desvantagens, indo desde uma cinética de ativação ineficiente a até possivelmente efeitos tóxicos dependendo do metabólito utilizado.

A indução de uma atividade gênica baseada em uma transmissão de
informa√ß√£o na velocidade de f√≥ton √© muito mais precisa, r√°pida e pr√°tica que qualquer outro metab√≥lito que exista pelos simples fatos de que um f√≥ton n√£o precisa ser “dissolvido” no citosol, n√£o precisa colidir com o seu alvo de alguma maneira particular para iniciar uma resposta enzim√°tica, e talvez o mais importante: um f√≥ton n√£o causa efeitos pleiotr√≥picos (i.e. ativa√ß√£o de um gene n√£o desejado) e n√£o antecipados como um metab√≥lito (Bem, isso se voc√™ tiver certeza de que n√£o h√° mais nenhum receptor de luz al√©m daquele que voc√™ vai usar na sua bact√©ria) Somado √† isso, a luz √© um indutor de resposta g√™nica barato, universalmente dispon√≠vel, simples de usar, n√£o-invasivo, at√≥xico, de alta inducibilidade e reversibilidade, e que pode ser facilmente utilizado em v√°rios sistemas.

Provavelmente no futuro a grande maioria dos mecanismos indutores de máquinas geneticamente modificadas deverão ser induzidos por luz, ou quem sabe por quaisquer outros tipos de indutores de expressão com características equiparáveis.

Para se ter uma noção do funcionamento de um switch de luz, mais particularmente de luz vermelha, vamos dar uma olhada no mecanismo molecular por trás dessa idéia.

Mecanismo Molecular

O mecanismo molecular de ativação por luz provém, como era de se esperar, de proteínas vegetais encontradas no cloroplasto. Elas estão envolvidas no fotoperiodismo das plantas, germinação de sementes, e síntese de clorofila, além de outras coisas. Essas proteínas são os fitocromos.

Os fitocromos não possuem atividade sensível à luz por si só: é
necess√°rio estar covalentemente ligado √† um crom√≥foro, que nas plantas √© a fitocromobilina (PŌÜB), e em cianobact√©rias √© a ficocianobilina (PCB), que √© o mais usado devido √† sua f√°cil purifica√ß√£o. Na aus√™ncia desses crom√≥foros n√£o h√° mudan√ßas conformacionais devido √† luz nos fitocromos, √© ele que capta a energia do f√≥ton e traduz em uma mudan√ßa conformacional na prote√≠na, culminando na mudan√ßa de sua funcionalidade.

O funcionamento deste biossensor sintético se dá através da construção de proteínas quiméricas a partir de receptores de luz e fatores de transcrição. Para receptores de luz vermelha (660 nm) há pelo menos dois tipos de mecanismos celulares construídos, que são os que vamos falar aqui, ambos utilizando uma idéia muito interessante: a fusão de partes de proteínas, as chamadas proteínas quimeras. Essa fusão vai além do aspecto estrutural e junta características funcionais de cada parte em uma proteína só. Não é demais!?

Um desses mecanismos, utilizando um híbrido entre fitocromo
(podendo ser A ou B) e o dom√≠nio quinase da prote√≠na de E.Coli EnvZ. Essa quimera possui um mecanismo de inibi√ß√£o atrav√©s da exposi√ß√£o √† luz vermelha: quando o dom√≠nio quinase est√° fosforilado, h√° a express√£o g√™nica (no caso, de lacZ, que induz a forma√ß√£o de um pigmento branco por a√ß√£o da express√£o de ő≤-Galactosidase), j√° na presen√ßa de luz vermelha, o dom√≠nio torna-se desfosforilado e inibe a express√£o (veja a imagem 1). Esse mecanismo molecular para a constru√ß√£o de um light switch foi o utilizado pelo time da universidade do Texas na competi√ß√£o de biologia sint√©tica realizada no ver√£o, no per√≠odo de atividades independentes do MIT de 2004, o qual impulsionou a cria√ß√£o do iGEM.

O outro mecanismo molecular atua através de duas quimeras: uma
resultante da fusão entre o fitocromo (A ou B) e o domínio de ligação ao DNA (GBD) da proteína GAL4, e a outra um híbrido de PIF3 (phytochrome interaction factor 3) e o domínio de ativação de transcrição (GAD), também do fator de transcrição GAL4. Quando não exposto à luz ou exposto à luz infra-vermelha (far-red light, FR), o fitocromo na conformação Pr (forma inativa) somente fica ligado ao DNA através do domínio do domínio GBD, porém quando exposto à luz vermelha, a proteína quimérica do fitocromo ganha a conformação Pfr (forma ativa) que se liga à PIF3-GAD com alta afinidade, o que induz a transcrição do gene alvo (veja a imagem 2).

Outras proteínas podem ser usadas substituindo PIF3, como FHY1
(far-red elongated hypocotyl 1) ou FHL (FHY1 like), fundidas à GAD também (imagem 3).

O grande diferencial deste √ļltimo mecanismo de switch √© a rapidez
de resposta gênica e fácil modulação. A conversão das formas Pr para Pfr ocorrem em milissegundos, e a transcrição em segundos. A indução reversa é igualmente rápida, exigindo apenas uma dissociação entre a quimera com GBD e a com GAD. Isso permite alto sincronismo e uma indução da expressão uniformizada na população celular.

Agora imagine a aplicabilidade disso, por exemplo, em uma ind√ļstria que precise produzir um biomedicamento que necessite ser constitu√≠do de propor√ß√Ķes de dois diferentes compostos. Ela teria que criar dois processos independentes de produ√ß√£o, dois biorreatores, uma unidade de mistura, teria que dosar as quantidades sendo misturadas e etc: iria ter que sustentar dois processos paralelos. Com um simples mecanismo molecular de light switch o
remédio ficaria muito mais barato e rápido de se produzir com apenas um apagar
e acender de l√Ęmpadas. Os dois constituintes do medicamento poderiam ser produzidos no mesmo biorreator e em propor√ß√Ķes que seguiriam apenas o tempo de exposi√ß√£o √† determinada luz, no caso deste post, luz vermelha e infravermelha. Bacana n√£o √©? E isso √© s√≥ um exemplo.

Para maiores e mais espec√≠ficas informa√ß√Ķes, vale dar uma olhada
nos papers aqui embaixo (a referência 3 traz um modelo matemático bem legal ).

1) Levskaya A, Chevalier AA, Tabor JJ, Simpson ZB, Lavery LA, Levy M, Davidson EA, Scouras A, Ellington AD, Marcotte EM, & Voigt CA (2005). Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light. Nature, 438 (7067), 441-2 PMID: 16306980

2)Shimizu-Sato S, Huq U, Tepperman JM, Quail PH (2002). A light-switchtable gene promoter system Nature Biotechnology, 1041-1044 DOI:10.1038

3) Sorokina O, Kapus A, Terecskei K, Dixon LE, Kozma-Bognar L, Nagy F, & Millar AJ (2009). A switchable light-input, light-output system modelled and constructed in yeast. Journal of biological engineering, 3 PMID: 19761615