Enquete: Qual projeto você acha mais interessante!?
Chegamos ao fim do ano com três projetos bastante interessantes para levarmos ao iGEM e queríamos a opinião de vocês sobre qual deles vocês acham mais legal e o porquê! Deêm uma conferida num resumo super rápido de cada proposta:
Plasmídeo Plug&Play
Cansado de ter que fazer vários passos metodológicos para transformar microrganismos? Você adoraria expressar um gene que você sempre quis em sua bactéria de um jeito fácil, rápido, barato e acessível? Chegou a solução! Com apenas dois pequenos passos você tem em mãos um kit de transformação “faça-você-mesmo” (DIY), sem precisar de equipamentos e reagentes caros! Basta fazer um PCR e depois a transformação! Esqueça outros passos como digestão, ligação, e vários outros PCRs cansativos! Veja aqui o link de um vídeo sobre a proposta.
Rede de Memória Associativa em Bactérias
Imagine se fosse possível reproduzir um comportamento cerebral… sem o cérebro! Esse é um tipo de desafio que muitos cientistas da computação e programadores andam trabalhando por aí. Na Biologia Sintética também! Inspirado em algumas publicações recentes envolvendo experimentos in vitro de sistemas com comportamento de uma rede neural, queremos criar um modelo in vivo disso, e sem usar neurônios: com populações de bactérias! Elas seriam capazes de reconhecer um padrão luminoso incompleto de uma “memória” que possuem e depois completar esse padrão, dando uma saída (output) luminosa com o padrão mais próximo de sua memória em relação ao padrão inicial dado. Já escrevemos um post sobre o caminho de ligações improváveis que fizemos para chegar na ideia desse projeto. Veja aqui o link de um vídeo sobre a proposta.
Sensor de Tensão Mecânica de Membrana
Nós temos mecanismos sensoriais bem parecidos dos que existem em microrganismos. Basicamente eles podem ser: metabólitos, temperatura, luz, voltagem, e até mesmo campos magnéticos. Mas e o “tato”!? Aquele tipo de sensor que usamos a todo momento! Como fazer microrganismos traduzirem um contato físico em uma resposta (igual por exemplo à essa plantinha aqui)!? É o que propõe a ideia desse projeto. Propor um novo sensor que pretende fazer microrganismos nos contarem que os estamos tocando (através desse Biobrick, um “stretch channel”), emitindo luz azul nesse processo (através desse Biobrick, Aequorina). No final, podemos aplicar isso igual ao esquema da figura aí em cima. Veja o link de um vídeo sobre a proposta aqui (< desatualizado, mas no mínimo dá pra entender de onde veio o insight da ideia).
E aí!? O que você acha? Dê o seu pitaco!
Switch de Luz Vermelha
Os mecanismos de ativação da expressão gênica majoritariamente utilizados em biologia sintética hoje, que utilizam pulsos de algum tipo de metabólito para a indução de uma resposta gênica, possuem diversas desvantagens, indo desde uma cinética de ativação ineficiente a até possivelmente efeitos tóxicos dependendo do metabólito utilizado.
A indução de uma atividade gênica baseada em uma transmissão de
informação na velocidade de fóton é muito mais precisa, rápida e prática que qualquer outro metabólito que exista pelos simples fatos de que um fóton não precisa ser “dissolvido” no citosol, não precisa colidir com o seu alvo de alguma maneira particular para iniciar uma resposta enzimática, e talvez o mais importante: um fóton não causa efeitos pleiotrópicos (i.e. ativação de um gene não desejado) e não antecipados como um metabólito (Bem, isso se você tiver certeza de que não há mais nenhum receptor de luz além daquele que você vai usar na sua bactéria) Somado à isso, a luz é um indutor de resposta gênica barato, universalmente disponível, simples de usar, não-invasivo, atóxico, de alta inducibilidade e reversibilidade, e que pode ser facilmente utilizado em vários sistemas.
Provavelmente no futuro a grande maioria dos mecanismos indutores de máquinas geneticamente modificadas deverão ser induzidos por luz, ou quem sabe por quaisquer outros tipos de indutores de expressão com características equiparáveis.
Para se ter uma noção do funcionamento de um switch de luz, mais particularmente de luz vermelha, vamos dar uma olhada no mecanismo molecular por trás dessa idéia.
Mecanismo Molecular
O mecanismo molecular de ativação por luz provém, como era de se esperar, de proteínas vegetais encontradas no cloroplasto. Elas estão envolvidas no fotoperiodismo das plantas, germinação de sementes, e síntese de clorofila, além de outras coisas. Essas proteínas são os fitocromos.
Os fitocromos não possuem atividade sensível à luz por si só: é
necessário estar covalentemente ligado à um cromóforo, que nas plantas é a fitocromobilina (PφB), e em cianobactérias é a ficocianobilina (PCB), que é o mais usado devido à sua fácil purificação. Na ausência desses cromóforos não há mudanças conformacionais devido à luz nos fitocromos, é ele que capta a energia do fóton e traduz em uma mudança conformacional na proteína, culminando na mudança de sua funcionalidade.
O funcionamento deste biossensor sintético se dá através da construção de proteínas quiméricas a partir de receptores de luz e fatores de transcrição. Para receptores de luz vermelha (660 nm) há pelo menos dois tipos de mecanismos celulares construídos, que são os que vamos falar aqui, ambos utilizando uma idéia muito interessante: a fusão de partes de proteínas, as chamadas proteínas quimeras. Essa fusão vai além do aspecto estrutural e junta características funcionais de cada parte em uma proteína só. Não é demais!?
Um desses mecanismos, utilizando um híbrido entre fitocromo
(podendo ser A ou B) e o domínio quinase da proteína de E.Coli EnvZ. Essa quimera possui um mecanismo de inibição através da exposição à luz vermelha: quando o domínio quinase está fosforilado, há a expressão gênica (no caso, de lacZ, que induz a formação de um pigmento branco por ação da expressão de β-Galactosidase), já na presença de luz vermelha, o domínio torna-se desfosforilado e inibe a expressão (veja a imagem 1). Esse mecanismo molecular para a construção de um light switch foi o utilizado pelo time da universidade do Texas na competição de biologia sintética realizada no verão, no período de atividades independentes do MIT de 2004, o qual impulsionou a criação do iGEM.
O outro mecanismo molecular atua através de duas quimeras: uma
resultante da fusão entre o fitocromo (A ou B) e o domínio de ligação ao DNA (GBD) da proteína GAL4, e a outra um híbrido de PIF3 (phytochrome interaction factor 3) e o domínio de ativação de transcrição (GAD), também do fator de transcrição GAL4. Quando não exposto à luz ou exposto à luz infra-vermelha (far-red light, FR), o fitocromo na conformação Pr (forma inativa) somente fica ligado ao DNA através do domínio do domínio GBD, porém quando exposto à luz vermelha, a proteína quimérica do fitocromo ganha a conformação Pfr (forma ativa) que se liga à PIF3-GAD com alta afinidade, o que induz a transcrição do gene alvo (veja a imagem 2).
Outras proteínas podem ser usadas substituindo PIF3, como FHY1
(far-red elongated hypocotyl 1) ou FHL (FHY1 like), fundidas à GAD também (imagem 3).
O grande diferencial deste último mecanismo de switch é a rapidez
de resposta gênica e fácil modulação. A conversão das formas Pr para Pfr ocorrem em milissegundos, e a transcrição em segundos. A indução reversa é igualmente rápida, exigindo apenas uma dissociação entre a quimera com GBD e a com GAD. Isso permite alto sincronismo e uma indução da expressão uniformizada na população celular.
Agora imagine a aplicabilidade disso, por exemplo, em uma indústria que precise produzir um biomedicamento que necessite ser constituído de proporções de dois diferentes compostos. Ela teria que criar dois processos independentes de produção, dois biorreatores, uma unidade de mistura, teria que dosar as quantidades sendo misturadas e etc: iria ter que sustentar dois processos paralelos. Com um simples mecanismo molecular de light switch o
remédio ficaria muito mais barato e rápido de se produzir com apenas um apagar
e acender de lâmpadas. Os dois constituintes do medicamento poderiam ser produzidos no mesmo biorreator e em proporções que seguiriam apenas o tempo de exposição à determinada luz, no caso deste post, luz vermelha e infravermelha. Bacana não é? E isso é só um exemplo.
Para maiores e mais específicas informações, vale dar uma olhada
nos papers aqui embaixo (a referência 3 traz um modelo matemático bem legal ).
1) Levskaya A, Chevalier AA, Tabor JJ, Simpson ZB, Lavery LA, Levy M, Davidson EA, Scouras A, Ellington AD, Marcotte EM, & Voigt CA (2005). Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light. Nature, 438 (7067), 441-2 PMID: 16306980
2)Shimizu-Sato S, Huq U, Tepperman JM, Quail PH (2002). A light-switchtable gene promoter system Nature Biotechnology, 1041-1044 DOI:10.1038
3) Sorokina O, Kapus A, Terecskei K, Dixon LE, Kozma-Bognar L, Nagy F, & Millar AJ (2009). A switchable light-input, light-output system modelled and constructed in yeast. Journal of biological engineering, 3 PMID: 19761615