Light Switches: Um Review

ResearchBlogging.orgJá tratamos nesse blog de um dispositivo simples, mas engenhoso, para a transdução de um sinal luminoso em uma resposta genética desejada, no caso um switch de luz vermelha. Mas podemos abranger o conceito de switch de luz para uma variada gama de mecanismos que a própria natureza esculpiu durante os milhares de anos que teve para se divertir sozinha antes que nós aprendêssemos a modificá-la.

Os mecanismos mais óbvios, que conhecemos bem antes de termos conhecimento da existência de uma célula, são os das plantas. Apesar de pensarmos nesses seres vivos como a fonte mais provável das ferramentas que precisamos para construir um light switch, a biologia sintética utilizou até agora principalmente os dispositivos fotossensíveis de microorganismos fototróficos e quimiotróficos, presentes em uma grande quantidade de bactérias.

As fun√ß√Ķes de muitos fotorreceptores ainda n√£o s√£o muito claras, mas alguns exemplos na natureza da atividade desses mecanismos v√£o desde a regula√ß√£o da motilidade celular, forma√ß√£o de pigmentos, reparo de DNA, resposta ao stress , √† at√© “comportamentos multicelulares”, como a forma√ß√£o de biofilmes e de corpos de frutifica√ß√£o, como por exemplo a Stigmantella aurantiaca.

Corpo de frutificação da Stigmantella aurantiaca.

Corpo de frutificação de Stigmantella aurantiaca. Retirado da publicação de van der Hornst et al, mencionada no final do post.

A grande maioria das prote√≠nas fotossens√≠veis que a sele√ß√£o natural p√īde criar nesses milh√Ķes de anos, e que at√© agora conhecemos, pode ser classificada em seis fam√≠lias bem definidas, baseada na estrutura do crom√≥foro¬†absorvedor de luz, que podem ser: as famosas rodopsinas, os aqui j√° conhecidos fitocromos, as xantopsinas, os criptocromos, as tamb√©m famosas fotropinas e as prote√≠nas de dom√≠nio BLUF (blue light sensing using flavin (FAD), dom√≠nio utilizador de flavina sens√≠vel √† luz azul).

A natureza √© sutil; ela parte de princ√≠pios b√°sicos e com eles (utilizando um bocado de tempo) cria as mais variadas solu√ß√Ķes para um mesmo problema. Com os fotorreceptores n√£o √© diferente. Uma procura de similaridade de sequ√™ncias que codificam esses seis tipos de fotorreceptores no mecanismo de busca protein BLAST do NCBI¬†revela uma grande quantidade de sequ√™ncias similares nos genomas de diferentes esp√©cies, indicando um vasto n√ļmero de receptores ainda n√£o caracterizados em diversos microorganismos. Um exemplo dessa busca pode ser visto da lista deste link: Chemotrophic organisms containing protein photoreceptor domains.

O princípio básico dos fotorreceptores é: uma estrutura molecular que contenha um ou mais domínios que captam a luz (input) e outro(s) que transforme(m) isso em um sinal intracelular (output). Os domínios de input ligam-se a cofatores ou cromóforos, resultando em uma molécula capaz de absorver luz UV ou visível. O domínio do output pode possuir uma atividade enzimática, proteína-ligante, ou DNA-ligante.  Vejamos alguns domínios de input e de output comumente encontrados in natura.

Domínios de Input Domínios de Output
AppA: Anti-repressor de pigmentos fotossint√©ticos. O AppA foi a primeira prote√≠na com dom√≠nio BLUF caracterizada em Rhodobacter sphaeroides. Absorve na regi√£o dos 446 nm com o seu crom√≥foro FAD. Al√©m de sens√≠vel √† luz, est√° envolvida em rea√ß√Ķes redox.BLUF: Um dom√≠nio presente em v√°rias prote√≠nas fotoativas, sua estrutura √© similar, mas com um mecanismo funcional totalmente diferente, ao dom√≠nio PAS.

LOV: Uma subclasse do dom√≠nio PAS, nomeado LOV devido ao tipo de sinal que esse dom√≠nio detecta: Luz-Oxig√™nio-Voltagem (light-oxygen-voltage). Esse tipo de dom√≠nio foi descoberto em fototropinas de plantas e mais recentemente em prote√≠nas bacterianas. Um tipo de dom√≠nio bem “popular”.

PAS: De “Per-Arnt-Sim”, tr√™s reguladores transcricionais que cont√™m esse tipo de dom√≠nio. Outro tipo de dom√≠nio bem “popular” no quesito receptor de luz. Muitas prote√≠nas com dom√≠nio PAS s√£o conhecidas por transmitir o seu sinal associando-se a cofatores.

Fitocromo: Receptor de luz vermelha e infravermelho encontrado em plantas e bactérias, ligando-se em uma cromóforo de bilina (Lembra do red light switch? A Ficocianobilina é um desses cromóforos).

PYP: De photoactive yellow protein (proteína fotoativa amarela). Um receptor de luz citoplasmático que usa ácido p-coumárico como seu cromóforo. Sua absorção máxima é em 446 nm.

Rodopsina: Proteína composta por um conjunto de sete hélices intermembrana (ver imagem na tabela abaixo), ligando-se a um cofator retinal em seu centro hidrofóbico, absorvendo em maior parte luz verde. Há uma grande quantidade de estudo sobre ela.

YtvA: Um bem caracterizado domínio fotoreceptor de luz azul em Bacillus subitilis. Possui um domínio LOV que se liga ao cromóforo monoflavina (FMN), o que resulta numa absorção máxima em torno de 449 nm.

EAL: Domínio com atividade enzimática diguanilato-fosfodiesterase (traduzindo: envolvido na hidrólise de di-GMP cíclico, um importante sinalizador intracelular). Chama-se EAL por causa de sua sequência conservada de resíduos, mas também conhecido como DUF2.GAF: Domínio com atividade de adenilato-ciclase, guanilato-ciclase, e fosfodiesterase. Liga-se à um cofator bilina em alguns fitocromos.GGDEF: Similar ao EAL, possui atividade de ciclase em diguanilatos (di-GMP). Também possui seu nome devido à sua sequência conservada, conhecido também por DUF1.

HisKA: Domínio fosfoaceptor e dimerizador de proteínas histidina-quinases, importantes proteínas na sinalização intracelular.

HTH: Domínio de ligação ao DNA de reguladores de transcrição bacterianos. Eles se ligam ao DNA via seu motivo (sequência específica de aminoácidos) helix-turn-helix (hélice-dobra-hélice).

STAS: O domínio STAS, cujo nome significa domínio transportador de sulfato e antagonista de fatores anti-sigma (traduzindo: promove a atividade do tal fator de transcrição sigma), é o domínio de output do bem caracterizado YtvA, mas também encontrado em outros fotoreceptores.

Sabendo como as coisas s√£o naturalmente, √© poss√≠vel juntar diferentes pe√ßas desse zool√≥gico de dom√≠nios proteicos e formar diferentes light switches. Vejamos por exemplo o red light switch: basta juntar um dom√≠nio input de fitocromo e um output de liga√ß√£o ao DNA, no caso o GAL4. Para sintetizar um switch de luz azul, verde, amarelo, e etc, o princ√≠pio fundamental √© o mesmo: basta montar um input e um output desejados. O resto √© pura metodologia e testes.¬†Alguns exemplos de constru√ß√Ķes naturais podem ser:

Combina√ß√Ķes naturais de diferentes dom√≠nios Input e Output.

Imagem modificada retirada da referência deste post (van der Hornst et al.).
 

Como se pode ver, o dom√≠nio de input LOV parece ser o mais vers√°til, o que talvez explique a sua “popularidade” no mundo bacteriano dos dom√≠nios fotossens√≠veis. Encontra-se um LOV input ligado √† v√°rios tipos diferentes de outputs.

Uma coisa interessante a se levar em conta nessas constru√ß√Ķes naturais √© o tempo de altern√Ęncia entre os diferentes estados dos fotorreceptores, que como vimos no red light switch, se resume (na maioria dos casos) a um estado “ativo” quando exposto a luz e um “inativo” quando no escuro ou quando passado certo tempo de exposi√ß√£o. Quando o ciclo de mudan√ßa do estado ativo para o inativo √© um pouco lento, ele √© geralmente compat√≠vel com regula√ß√Ķes na express√£o g√™nica, enquanto graus r√°pidos de mudan√ßa s√£o relacionados com uma regula√ß√£o comportamental (que n√£o envolve diretamente uma regula√ß√£o g√™nica, como por exemplo o aumento da taxa de motilidade de uma bact√©ria quando exposta √† luz). Um ciclo de mudan√ßa ainda mais r√°pido sugere fun√ß√Ķes bioenerg√©ticas para o fotoreceptor. Isso √© um par√Ęmetro importante a se levar em conta no design de dispositivos sint√©ticos fotossens√≠veis.

No fundo, talvez grande parte da pr√≥pria biologia¬† sint√©tica se resume ao que discutimos aqui: mudan√ßa de informa√ß√£o com recombina√ß√£o. Ca√≠mos ent√£o no ponto recursivo da biologia. √Ä diferentes n√≠veis e abordagens sempre teremos¬† a mesma simples met√°fora dos blocos de montar: os blocos sempre s√£o os mesmos, o que muda √© a informa√ß√£o que colocamos neles ao fazermos diferentes estruturas com diferentes combina√ß√Ķes das unidades. Quer um light switch espec√≠fico que ainda n√£o foi feito? J√° est√° pronto, s√≥ basta combinar informa√ß√£o.

Em posts futuros mostraremos como combinar inputs e outputs para criar light switches de outras cores, novamente, com as constru√ß√Ķes feitas pelos de times de edi√ß√Ķes passadas do iGEM. Para maiores e melhores informa√ß√Ķes sobre fotorreceptores, vale consultar o √≥timo review de Michael van der Hornst et al:

van der Horst MA, Key J, & Hellingwerf KJ (2007). Photosensing in chemotrophic, non-phototrophic bacteria: let there be light sensing too. Trends in microbiology, 15 (12), 554-62 PMID: 18024131