Light Switches: Um Review

ResearchBlogging.orgJá tratamos nesse blog de um dispositivo simples, mas engenhoso, para a transdução de um sinal luminoso em uma resposta genética desejada, no caso um switch de luz vermelha. Mas podemos abranger o conceito de switch de luz para uma variada gama de mecanismos que a própria natureza esculpiu durante os milhares de anos que teve para se divertir sozinha antes que nós aprendêssemos a modificá-la.

Os mecanismos mais óbvios, que conhecemos bem antes de termos conhecimento da existência de uma célula, são os das plantas. Apesar de pensarmos nesses seres vivos como a fonte mais provável das ferramentas que precisamos para construir um light switch, a biologia sintética utilizou até agora principalmente os dispositivos fotossensíveis de microorganismos fototróficos e quimiotróficos, presentes em uma grande quantidade de bactérias.

As fun√ß√Ķes de muitos fotorreceptores ainda n√£o s√£o muito claras, mas alguns exemplos na natureza da atividade desses mecanismos v√£o desde a regula√ß√£o da motilidade celular, forma√ß√£o de pigmentos, reparo de DNA, resposta ao stress , √† at√© “comportamentos multicelulares”, como a forma√ß√£o de biofilmes e de corpos de frutifica√ß√£o, como por exemplo a Stigmantella aurantiaca.

Corpo de frutificação da Stigmantella aurantiaca.

Corpo de frutificação de Stigmantella aurantiaca. Retirado da publicação de van der Hornst et al, mencionada no final do post.

A grande maioria das prote√≠nas fotossens√≠veis que a sele√ß√£o natural p√īde criar nesses milh√Ķes de anos, e que at√© agora conhecemos, pode ser classificada em seis fam√≠lias bem definidas, baseada na estrutura do crom√≥foro¬†absorvedor de luz, que podem ser: as famosas rodopsinas, os aqui j√° conhecidos fitocromos, as xantopsinas, os criptocromos, as tamb√©m famosas fotropinas e as prote√≠nas de dom√≠nio BLUF (blue light sensing using flavin (FAD), dom√≠nio utilizador de flavina sens√≠vel √† luz azul).

A natureza √© sutil; ela parte de princ√≠pios b√°sicos e com eles (utilizando um bocado de tempo) cria as mais variadas solu√ß√Ķes para um mesmo problema. Com os fotorreceptores n√£o √© diferente. Uma procura de similaridade de sequ√™ncias que codificam esses seis tipos de fotorreceptores no mecanismo de busca protein BLAST do NCBI¬†revela uma grande quantidade de sequ√™ncias similares nos genomas de diferentes esp√©cies, indicando um vasto n√ļmero de receptores ainda n√£o caracterizados em diversos microorganismos. Um exemplo dessa busca pode ser visto da lista deste link: Chemotrophic organisms containing protein photoreceptor domains.

O princípio básico dos fotorreceptores é: uma estrutura molecular que contenha um ou mais domínios que captam a luz (input) e outro(s) que transforme(m) isso em um sinal intracelular (output). Os domínios de input ligam-se a cofatores ou cromóforos, resultando em uma molécula capaz de absorver luz UV ou visível. O domínio do output pode possuir uma atividade enzimática, proteína-ligante, ou DNA-ligante.  Vejamos alguns domínios de input e de output comumente encontrados in natura.

Domínios de Input Domínios de Output
AppA: Anti-repressor de pigmentos fotossint√©ticos. O AppA foi a primeira prote√≠na com dom√≠nio BLUF caracterizada em Rhodobacter sphaeroides. Absorve na regi√£o dos 446 nm com o seu crom√≥foro FAD. Al√©m de sens√≠vel √† luz, est√° envolvida em rea√ß√Ķes redox.BLUF: Um dom√≠nio presente em v√°rias prote√≠nas fotoativas, sua estrutura √© similar, mas com um mecanismo funcional totalmente diferente, ao dom√≠nio PAS.

LOV: Uma subclasse do dom√≠nio PAS, nomeado LOV devido ao tipo de sinal que esse dom√≠nio detecta: Luz-Oxig√™nio-Voltagem (light-oxygen-voltage). Esse tipo de dom√≠nio foi descoberto em fototropinas de plantas e mais recentemente em prote√≠nas bacterianas. Um tipo de dom√≠nio bem “popular”.

PAS: De “Per-Arnt-Sim”, tr√™s reguladores transcricionais que cont√™m esse tipo de dom√≠nio. Outro tipo de dom√≠nio bem “popular” no quesito receptor de luz. Muitas prote√≠nas com dom√≠nio PAS s√£o conhecidas por transmitir o seu sinal associando-se a cofatores.

Fitocromo: Receptor de luz vermelha e infravermelho encontrado em plantas e bactérias, ligando-se em uma cromóforo de bilina (Lembra do red light switch? A Ficocianobilina é um desses cromóforos).

PYP: De photoactive yellow protein (proteína fotoativa amarela). Um receptor de luz citoplasmático que usa ácido p-coumárico como seu cromóforo. Sua absorção máxima é em 446 nm.

Rodopsina: Proteína composta por um conjunto de sete hélices intermembrana (ver imagem na tabela abaixo), ligando-se a um cofator retinal em seu centro hidrofóbico, absorvendo em maior parte luz verde. Há uma grande quantidade de estudo sobre ela.

YtvA: Um bem caracterizado domínio fotoreceptor de luz azul em Bacillus subitilis. Possui um domínio LOV que se liga ao cromóforo monoflavina (FMN), o que resulta numa absorção máxima em torno de 449 nm.

EAL: Domínio com atividade enzimática diguanilato-fosfodiesterase (traduzindo: envolvido na hidrólise de di-GMP cíclico, um importante sinalizador intracelular). Chama-se EAL por causa de sua sequência conservada de resíduos, mas também conhecido como DUF2.GAF: Domínio com atividade de adenilato-ciclase, guanilato-ciclase, e fosfodiesterase. Liga-se à um cofator bilina em alguns fitocromos.GGDEF: Similar ao EAL, possui atividade de ciclase em diguanilatos (di-GMP). Também possui seu nome devido à sua sequência conservada, conhecido também por DUF1.

HisKA: Domínio fosfoaceptor e dimerizador de proteínas histidina-quinases, importantes proteínas na sinalização intracelular.

HTH: Domínio de ligação ao DNA de reguladores de transcrição bacterianos. Eles se ligam ao DNA via seu motivo (sequência específica de aminoácidos) helix-turn-helix (hélice-dobra-hélice).

STAS: O domínio STAS, cujo nome significa domínio transportador de sulfato e antagonista de fatores anti-sigma (traduzindo: promove a atividade do tal fator de transcrição sigma), é o domínio de output do bem caracterizado YtvA, mas também encontrado em outros fotoreceptores.

Sabendo como as coisas s√£o naturalmente, √© poss√≠vel juntar diferentes pe√ßas desse zool√≥gico de dom√≠nios proteicos e formar diferentes light switches. Vejamos por exemplo o red light switch: basta juntar um dom√≠nio input de fitocromo e um output de liga√ß√£o ao DNA, no caso o GAL4. Para sintetizar um switch de luz azul, verde, amarelo, e etc, o princ√≠pio fundamental √© o mesmo: basta montar um input e um output desejados. O resto √© pura metodologia e testes.¬†Alguns exemplos de constru√ß√Ķes naturais podem ser:

Combina√ß√Ķes naturais de diferentes dom√≠nios Input e Output.

Imagem modificada retirada da referência deste post (van der Hornst et al.).
 

Como se pode ver, o dom√≠nio de input LOV parece ser o mais vers√°til, o que talvez explique a sua “popularidade” no mundo bacteriano dos dom√≠nios fotossens√≠veis. Encontra-se um LOV input ligado √† v√°rios tipos diferentes de outputs.

Uma coisa interessante a se levar em conta nessas constru√ß√Ķes naturais √© o tempo de altern√Ęncia entre os diferentes estados dos fotorreceptores, que como vimos no red light switch, se resume (na maioria dos casos) a um estado “ativo” quando exposto a luz e um “inativo” quando no escuro ou quando passado certo tempo de exposi√ß√£o. Quando o ciclo de mudan√ßa do estado ativo para o inativo √© um pouco lento, ele √© geralmente compat√≠vel com regula√ß√Ķes na express√£o g√™nica, enquanto graus r√°pidos de mudan√ßa s√£o relacionados com uma regula√ß√£o comportamental (que n√£o envolve diretamente uma regula√ß√£o g√™nica, como por exemplo o aumento da taxa de motilidade de uma bact√©ria quando exposta √† luz). Um ciclo de mudan√ßa ainda mais r√°pido sugere fun√ß√Ķes bioenerg√©ticas para o fotoreceptor. Isso √© um par√Ęmetro importante a se levar em conta no design de dispositivos sint√©ticos fotossens√≠veis.

No fundo, talvez grande parte da pr√≥pria biologia¬† sint√©tica se resume ao que discutimos aqui: mudan√ßa de informa√ß√£o com recombina√ß√£o. Ca√≠mos ent√£o no ponto recursivo da biologia. √Ä diferentes n√≠veis e abordagens sempre teremos¬† a mesma simples met√°fora dos blocos de montar: os blocos sempre s√£o os mesmos, o que muda √© a informa√ß√£o que colocamos neles ao fazermos diferentes estruturas com diferentes combina√ß√Ķes das unidades. Quer um light switch espec√≠fico que ainda n√£o foi feito? J√° est√° pronto, s√≥ basta combinar informa√ß√£o.

Em posts futuros mostraremos como combinar inputs e outputs para criar light switches de outras cores, novamente, com as constru√ß√Ķes feitas pelos de times de edi√ß√Ķes passadas do iGEM. Para maiores e melhores informa√ß√Ķes sobre fotorreceptores, vale consultar o √≥timo review de Michael van der Hornst et al:

van der Horst MA, Key J, & Hellingwerf KJ (2007). Photosensing in chemotrophic, non-phototrophic bacteria: let there be light sensing too. Trends in microbiology, 15 (12), 554-62 PMID: 18024131

Como montar o seu próprio laboratório de garagem?

Aqui no SynBio Brasil já foi comentado sobre a onda cada vez mais crescente de pessoas desenvolvendo seus próprios experimentos de Biologia Sintética em suas garagens, o DIYBio. Mas quais são os equipamentos necessários (e mais baratos) para montar o seu próprio laboratório? A revista Nature publicou uma reportagem no ano passado sobre esse assunto e identificou os seguintes equipamentos que não podem faltar em um laboratório de SynBio de garagem:

Equipamentos b√°sicos:

1) Pipetas ($275 ‚Äď $630): Servem para a aplica√ß√£o de subst√Ęncias com volume controlado

2) Freezer -20¬ļC ($180 ‚Äď $500): Serve para refrigerar amostras, culturas, enzimas, etc.

3) Equipamento para corridas de gel ($115 – $190): Identificar e separar fragmentos de DNA ou RNA

4) Shaker ($50 – $400): Serve para misturar solu√ß√Ķes

5) Balança ($5 Р$3,000): Serve para medir massas

6) Chapa de aquecimento ($100 – $200): Serve para o aquecimento de
solu√ß√Ķes

Equipamentos que podem ser improvisados:

1) Autoclave ($250 – $2,000): Esteriliza solu√ß√Ķes e materiais

2) Microcentr√≠fuga ($60 – $850): Centrifuga solu√ß√Ķes

3) Incubador ($100 Р$800): Mantém amostras aquecidas

4) Termociclador ou M√°quina de PCR ($195 – $1,000): Faz ciclos de
amplificação de segmentos de DNA

Equipamentos que exigem um investimento alto:

1) Exaustor ($500 ‚Äď $7,000): Mant√©m a bancada est√©ril e livre de
gases tóxicos

2) HPLC ($2,000 – $54,000): Qualifica e quantifica subst√Ęncias de
uma amostra

3) Espectr√īmetro UV/VIS ($180 – $3,000): Quantifica e define a pureza em que uma subst√Ęncia est√° em uma amostra

Além disso, eu incluiria um pHmetro ($30 Р$800), pois é muito importante para a confecção de alguns meios de cultura manter as
condi√ß√Ķes de pH adequadas ao organismo que ser√° cultivado; al√©m de um microsc√≥pio, √ļtil para identificar coisas b√°sicas como o tipo celular que est√° crescendo em sua cultura, com base na forma ou colora√ß√Ķes de Gram.

Para alguns, o pre√ßo de certos equipamentos pode parecer um empecilho muito grande no desenvolvimento de um laborat√≥rio de garagem, mas a revista mostra exemplos de ‚ÄúBiohakers‚ÄĚ que buscaram financiamento para suas pesquisas atrav√©s de sites solicitando doa√ß√Ķes com base em seus projetos como o Kickstarter. Outra op√ß√£o √© se unir aos ‚ÄúEngenheiros de Garagem‚ÄĚ e montar seus pr√≥prios equipamentos! Segundo a revista, √© poss√≠vel fazer um microsc√≥pio de $10 adaptando-se a lentes de uma webcam, ou at√© mesmo dispensar um incubador e aquecer amostras nas pr√≥prias axilas (eu mesmo j√° cheguei a aquecer amostras congeladas de Taq polimerase com as pr√≥prias m√£os!!!). No Brasil, um bom come√ßo para esse tipo de parceria √© a rede social Laborat√≥rio de Garagem em que pessoas trocam informa√ß√Ķes sobre diversas formas de se construir equipamentos com baixo custo.

Com todas essas informa√ß√Ķes, n√£o h√° desculpas para os Bi√≥logos de Plant√£o come√ßarem a botar a m√£o na massa!!!

Portas Lógicas em Sistemas Gênicos

ResearchBlogging.org

A associa√ß√£o da biologia sint√©tica com a eletr√īnica √© bem grande. A semelhan√ßa entre a intera√ß√£o de enzimas, fatores de transcri√ß√£o e DNA, e circuitos el√©tricos gera uma interessante conex√£o interdisciplinar entre engenharia el√©trica e biologia, tanto que os pr√≥prios fundadores do iGEM e do registry of parts s√£o engenheiros el√©tricos!

Algumas boas analogias, ou melhor, interpreta√ß√Ķes dos sistemas g√™nicos, s√£o feitas com o uso de portas l√≥gicas para classificar o comportamento das intera√ß√Ķes g√™nicas. Portas l√≥gicas baseiam-se na l√≥gica booleana, usada largamente em computa√ß√£o. Para entender melhor, vamos ver uns dois exemplos: o NOR e AND.

NOR¬†(“not OR”, o inverso do resultado para a porta OR, conhecido tamb√©m como NEM):

Imagem retirada e modificada da referência (Khalil, A., & Collins, J.).
 

Como j√° foi mostrado aqui no blog, esse dispositivo possui dois estados est√°veis que podem ser ligados ou desligados atrav√©s de inputs espec√≠ficos. Retirando esse input, no caso sinais ex√≥genos como calor e IPTG, o sistema preserva o seu estado, criando assim uma forma molecular n√£o exclusivamente estrutural (i.e. conforma√ß√£o de prote√≠nas e etc) de mem√≥ria na c√©lula. O racioc√≠nio √© o mesmo em eletr√īnica, como no circuito flip-flop¬†do tipo set-reset, que √© capaz de servir como uma mem√≥ria de um bit em circuitos digitais.

O sistema pode ser interpretado atrav√©s da tabela verdade de NOR: As entradas s√£o as intera√ß√Ķes (de repress√£o ou ativa√ß√£o) do sinal ex√≥geno e do produto g√™nico, enquanto os n√ļmeros 0 e 1 associados √† falso e verdadeiro, podem ser interpretados respectivamente como repress√£o e ativa√ß√£o nas colunas da entrada, e exist√™ncia (um) ou n√£o (zero) de
um output na coluna da sa√≠da. Ent√£o por exemplo, tendo A como o calor (heat) e B como a prote√≠na repressora Cl (produzida por cl-ts) s√≥ se ter√° uma sa√≠da (o n√ļmero 1), ou melhor, um estado est√°vel do toggle (em que √© expresso apenas um conjunto de genes), se houver uma intera√ß√£o entre repress√Ķes, ou seja, a repress√£o do repressor, no caso o calor reprimindo a repress√£o de Cl de lacl, que produz um estado est√°vel de produ√ß√£o de Ptrc2 e GFP (green flourescent protein). Para o outro estado est√°vel, com produ√ß√£o de Cl e repress√£o do gene lacl, a id√©ia √© a mesma, basta fazer A igual √† IPTG e B igual √† Ptrc2.

AND (conhecido também por E):

Imagem retirada e modificada da referência (Khalil, A., & Collins, J.).
 

Nesse exemplo, s√£o necess√°rios dois inputs para se obter o output: um de arabinose para transcrever a polimerase T7 com dois stop codons √Ęmbar (√© uma classe de stop codons, representada no desenho como pequeninos c√≠rculos vermelhos com pontas) no c√≥digo do seu gene (a polimerase √© necess√°ria para expressar o sinal de GFP); e outro sinal de salicilato que promove a transcri√ß√£o de supD, um RNA transportador supressor de stop codons √Ęmbar. Desse modo, tomando A da tabela verdade como a arabinose, e B como salicilato, pode-se ver claramente que apenas com a ativa√ß√£o da transcri√ß√£o feita por esses fatores a express√£o desses dois genes, pode ocorrer o output de luz fluorescente verde dada pela GFP: o produto de supD suprime os stop codons do gene t7pol, permitindo a transcri√ß√£o completa de polimerase T7.

Esse √© um exemplo de qu√£o sofisticado um sistema g√™nico pode ser ao se ligar a informa√ß√£o sensorial de m√ļltiplos elementos sensitivos a uma express√£o g√™nica programada. O interessante dessa interface entre engenharia el√©trica e microbiologia √© a possibilidade de constru√ß√£o de sistemas g√™nicos com o mesmo princ√≠pio de uma s√©rie de outros dispositivos j√° existentes na engenharia, e tamb√©m o contr√°rio: (porque n√£o!?) usar os dispositivos moleculares que a pr√≥pria natureza criou e aplic√°-los na eletr√īnica.

Para mais informa√ß√Ķes sobre outros sistemas bem interessantes, vale ver o review muito legal sobre biologia sint√©tica:

Khalil, A., & Collins, J. (2010). Synthetic biology: applications come of age Nature Reviews Genetics, 11 (5), 367-379 DOI: 10.1038/nrg2775

As 50 empresas mais quentes de bioenergia

Acabou de sair um ranking de empresas que reconhece a inova√ß√£o e os avan√ßos em¬† bioenergia. Entre as 50, 37 s√£o dos EUA, 15 s√£o ativas no desenvolvimento do etanol celul√≥sico, 5 desenvolvem algas para solu√ß√Ķes energ√©ticas e 16 produzem novos biocombust√≠veis avan√ßados como o biobutanol,¬† biodiesel, gasolina e combust√≠veis de jato renov√°veis.

Veja a reportagem completa:

http://biofuelsdigest.com/bdigest/2010/12/07/the-50-hottest-companies-in-bioenergy-for-2010-11/

The 50 Hottest Companies in Bioenergy for 2010-11 are:

Last year’s rank (2009-10)

1.            Amyris                              3

2.            Solazyme                          1

3.           POET                                 2

4.            LS9                                    8

5.            Gevo                                 13

6.            DuPont Danisco            7

7.            Novozymes                       11

8.             Coskata                             6

9.             Codexis                            35

10.            Sapphire Energy            5

11.             Virent                              21

12.             Mascoma                        10

13.             Ceres                                28

14.             Cobalt Technologies     30

15.             Honeywell’s UOP           12

16.             Enerkem                          25

17.             BP Biofuels                        4

18.             Genencor                         26

19.             Petrobras                          18

20.             Abengoa Energy             15

21.             Qteros                                22

22.             Joule Unlimited              32

23.             Shell                                    27

24.             Bluefire Renewables        19

25.             Rentech                              38

26.             Algenol                                24

27.             ZeaChem                             20

28.             PetroAlgae                          16

29.             Neste                                    29

30.             Synthetic Genomics           17

31.             LanzaTech                            41

32.             Iogen                                    23

33.             OriginOil                             42

34.             RangeFuels                         14

35.             ExxonMobil                        29

36.             Cargill                                    NR

37.             SG Biofuels                          49

38.             Butamax                              38

39.             Terrabon                              47

40.             Cosan                                    NR

41.             Verenium                              9

42.             Waste Management            42

43.             IneosBio                                36

44.             Dynamic Fuels                     NR

45.             Fulcrum Bioenergy              48

46.             KL Energy                             34

47.            KiOR                                       NR

48.             Chevron                                 NR

49.             Monsanto                              NR

50.             Inbicon                                    50

Produção de biodiesel por bactérias

ResearchBlogging.org

Imagine uma planta√ß√£o enorme de soja no interior do Mato Grosso e uma instala√ß√£o para a extra√ß√£o do √≥leo de soja, que √© composto por v√°rios √°cidos graxos. Agora imagine no interior de S√£o Paulo, uma grande usina de etanol cercada por dezenas de quil√īmetros por cana-de-a√ß√ļcar. Imagine o etanol e √≥leo de soja sendo transportados at√© uma usina de biodiesel para, utilizando um catalisador (normalmente hidr√≥xido de s√≥dio), serem esterificados em um √©ster (biodiesel) e em glicerina. Muito trabalho e muito recurso para produzir um biocombust√≠vel n√£o acham?

Recentemente, um trabalho muito interessante foi publicado pelo Jbei Instute demonstrando a possibilidade de se utilizar uma bact√©ria para produzir biodiesel em apenas uma etapa, e ainda por cima, utilizando res√≠duos agroindustriais, como por exemplo, o baga√ßo de cana-de-a√ß√ļcar. Essa bact√©ria modificada geneticamente √© capaz de produzir √°cidos graxos e etanol e enzimaticamente realizar a esterifica√ß√£o desses produtos em biodiesel. Bacana n√£o √©? Os detalhes da pesquisa ser√£o descritos a seguir.

√Ācidos graxos t√™m sido utilizados h√° s√©culos para a produ√ß√£o de combust√≠veis e produtos qu√≠micos, incluindo o biodiesel, surfactantes, solventes e lubrificantes. Por√©m a demanda crescente e a produ√ß√£o limitada de √≥leos vegetais t√™m causado questionamentos sobre o aumento dos pre√ßos dos alimentos, sobre a pr√°tica de utiliza√ß√£o dos solos e os aspectos socioambientais relacionados com a sua produ√ß√£o. Uma alternativa √© a produ√ß√£o desses derivados de √°cidos graxos via convers√£o biol√≥gica utilizando microrganismos como levedura e bact√©rias. Dentro desses produtos, os etil-√©steres de √°cidos graxos (o famoso biodiesel) t√™m despertado muito interesse. S√≥ para ilustrar, a demanda mundial de diesel vem crescendo tr√™s vezes mais que a de gasolina.

√Ācidos graxos s√£o produzidos naturalmente por microrganismos, eles comp√Ķem, entre outras coisas, a membrana celular. Por√©m, Jay Keasling e seu grupo constru√≠ram uma E. coli geneticamente modificada capaz de produzir √°cidos graxos livres (atrav√©s da express√£o de uma tioesterase citoplasm√°tica e da dele√ß√£o de genes respons√°veis pela degrada√ß√£o de √°cidos graxos) e etanol (expressando os genes de Zymomonas mobilis). Al√©m disso, foi clonada uma enzima (Acr1) capaz de realizar a transesterifica√ß√£o em bioedisel, sendo que que a glicerina produzida √© reabsorvida pela bact√©ria para a produ√ß√£o de mais biodiesel.

O tamanho e a saturação do ácido graxo influenciam diretamente nas propriedades químicas do biodiesel, como temperatura de fusão. Alguns trabalhos têm demonstrado que,
atrav√©s da express√£o de tioesterases de plantas, √© poss√≠vel produzir √°cidos graxos sob medida para diferentes aplica√ß√Ķes. Essa ferramenta gen√©tica possibilita a produ√ß√£o de biodiesel com composi√ß√Ķes definidas, dessa maneira, com performance e caracter√≠sticas desenvolvidas sob medida.

Por fim, essas bact√©rias foram modificadas para utilizar mat√©rias-primas de baixo custo, como a hemicelulose presente no baga√ßo de cana-de-a√ß√ļcar. √Č uma pesquisa pioneira que mostra bem o tipo de engenharia sist√™mica de metabolismo microbiano que vem sido feita. Atrav√©s de v√°rias modifica√ß√Ķes gen√©ticas foi poss√≠vel aumentar a produ√ß√£o de 40 mg/l para quase 700 mg/l de biodiesel. Resultado este ainda baixo para se cogitar uma aplica√ß√£o a curto-prazo, mas, sem sombra de d√ļvida, as perspectivas s√£o muito animadoras.

Steen EJ, Kang Y, Bokinsky G, Hu Z, Schirmer A, McClure A, Del Cardayre SB, & Keasling JD (2010). Microbial production of fatty-acid-derived fuels and chemicals from plant biomass. Nature, 463 (7280), 559-62 PMID: 20111002