Dispositivos sintéticos: uma bactéria que conta!

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Para quem n√£o leu, antes de ler este post, vale a pena ler o post anterior do interruptor para entender alguns conceitos b√°sicos. Um contador √© um componente central para circuitos digitais e de computa√ß√£o que guarda (e √†s vezes mostra)¬†o n√ļmero de eventos ou processos que ocorreram.

Neste trabalho é descrita a construção de contadores sintéticos para bactérias. Após a construção de um dispositivo aparentemente simples, Friedland et al. (2009) sofisticam bastante a construção do regulador para garantir uma resposta (contagem) robusta.

O primeiro contador descrito pelo trabalho √© o¬†“contador riborregulado por uma cascada transcricional” (riboregulated transcriptional cascade counter). Ele conta pulsos de arabinose no meio de cultura utilizando como sinal uma prote√≠na luminescente (GFP). S√£o riborregulados porque o taRNA (controlado por um promotor sens√≠vel a arabinose) se liga a cr e impede a forma√ß√£o de um grampo (pareamento) entre RBS e cr. Dessa maneira,¬† permite o reconhecimento do RBS (s√≠tio de liga√ß√£o do ribossomo) pelo ribossomo e a tradu√ß√£o do gene (ver Figura abaixo). O interessante √© que a transcri√ß√£o do taRNA √© regulada por um promotor sens√≠vel a arabinose. Assim, no primeiro pulso de arabinose, ocorre a transcri√ß√£o de taRNA que permite a tradu√ß√£o da RNA polimerase T7. Ap√≥s o primeiro pulso a arabinose e taRNA s√£o degradados. No segundo pulso ocorre, da mesma maneira, a transcri√ß√£o da RNA polimerase T3 atrav√©s do promotor PT7 que √© especificamente reconhecido pela RNA polimerase T7. No terceiro pulso, ocorre tamb√©m atrav√©s da media√ß√£o de taRNA e da polimerase T3, a transcri√ß√£o de GFP. Dessa maneira, a bact√©ria responde aos 3 pulsos de arabinose com um sinal luminescente.

Porém foi verificado um vazamento de expressão de GFP nos pulsos intermediários, além disso, demonstrou-se que se o pulso de arabinose não é dado a uma intensidade e frequência corretas, o contador  não funciona direito. Isto provavelmente ocorre devido aos limites cinéticos intrínsecos envolvendo os tempos de transcrição e degradação de mRNA.

Por esse motivo, um segundo (e muito mais bacana) contador foi construído, chamado contador de cascada de DNA invertase (DNA invertase cascade counter). Que basicamente acoplou ao modelo anterior um controle de invertases na região promotora.

Uma invertase √© uma enzima muito interessante, as enzimas Cre, por ex., reconhecem determinadas sequ√™ncias de DNA que flanqueiam uma determinada regi√£o de DNA e invertem a orienta√ß√£o dessa regi√£o. Essa enzima √© utilizada para ativar os promotores atrav√©s da invers√£o de sua orienta√ß√£o (ver Figura abaixo). Com essa constru√ß√£o foi poss√≠vel obter um controle muito maior da express√£o de GFP, ocorrendo, ap√≥s o terceiro pulso, uma express√£o muito maior de GFP. Este contador agora √© muito mais robusto em rela√ß√£o¬†√† varia√ß√£o de tempo entre os pulsos de arabinose, podendo contar pulsos realizados em intervalos de tempo de 2 a 12 horas. Este novo dispositivo, al√©m de mostrar o sinal luminescente, grava a informa√ß√£o no DNA atrav√©s das recombina√ß√Ķes.

Os autores foram ainda mais longe, trocaram o promotor de sensibilidade a arabinose por promotores capazes de responder a diferentes sinais. Dessa maneira, o dispositivo pode ser programado para gravar e responder diferentes sinais na ordem desejada. Incrível!

Esse dispositivo gen√©tico pode ser programado para diferentes fun√ß√Ķes a fim de sincronizar diferentes sinais para uma determinada resposta. Dependendo dos sinais acoplados ao dispositivo, estes mecanimos podem ser utilizados para biosensores, biorremedia√ß√£o ou na medicina.

Friedland, A., Lu, T., Wang, X., Shi, D., Church, G., & Collins, J. (2009). Synthetic Gene Networks That Count Science, 324 (5931), 1199-1202 DOI: 10.1126/science.1172005