CRISPR: nova e revolucionária técnica para edição de genoma


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Ter o genoma sequenciado por apenas 1000 dólares em breve será uma realidade. E não é somente ler o genoma que está se tornando cada vez mais acessível, descobertas recentes resultaram em uma nova ferramenta de edição de genoma que promete revolucionar a pesquisa médica e o tratamento de algumas doenças. Este mecanismo, chamado de CRISPR, é baseado num sistema de defesa contra vírus, uma espécie de sistema imunológico, encontrado em bactérias. E mais uma aprendemos algo interessante com estes seres unicelulares (discutimos num post anterior como bactérias podem ajudar a combater o cancer).

Editando o genoma para curar doenças

Tornar o tratamento de desordens gen√©ticas √© sem d√ļvida uma das mais excitantes possibilidades desta nova t√©cnica, principalmente disordens causadas por uma ou poucas muta√ß√Ķes, tais como doen√ßa de¬†Huntington. Para comprovar que isto pode ser feito, cientistas do MIT, em experimentos em camundongos, conseguiram curar em uma doen√ßa rara que ataca o f√≠gado e √© causado pela muta√ß√£o de apenas um par de base de DNA. Esta doen√ßa, que tamb√©m ocorre em humanos, afeta 1 em cada 100.000 pessoas e consiste na falha da quebra do amino√°cido tirosina que acumula e afeta o funcionamento do f√≠gado. Utilizando a t√©cnica de CRISPR os cientistas conseguiram corrigir o gene para 1 em cada 250 c√©lulas do figado (hepat√≥citos) dos camundongos. Depois de 30 dias estas c√©lulas proliferaram e substituiram parte das c√©lulas com o gene defeituoso chegando a um ter√ßo da popula√ß√£o total de c√©lulas, o que foi suficiente para curar a doen√ßa. Veja o artigo publicado na Nature.

Mecanismo básico das ferramentas de edição de genoma

crisprBasicamente, o mecanismo de edição de genoma consiste em um sistema para reconhecer o sítio onde haverá a mudança combinado a um mecanismo de corte do DNA (nucleases). Uma vez reconhecido o local de corte as nucleases agem fazendo um corte nas duas fitas do DNA. Uma vez cortado, mecanismos de reparação do genoma tendem a juntar as fitas novamente e neste processo um pedaço de DNA pode ser removido ou até mesmo trocado por outro pedaço de DNA.

As primeiras técnicas desenvolvidas, tanto Zinc finger nucleases quanto TALEN, utilizam proteínas para reconhecer o sítio de corte no genoma. Proteínas são pesadas e díficeis de projetar, diferentemente de RNA que pode ser facilmente sintetizado. E é aí que está a grande inovação da técnica de CRISPR, em utilizar pequenos pedaços de RNA para identificar o sítio de corte, o que torna a técnica simples e de baixo custo.

Recomendo os seguintes v√≠deos/anima√ß√Ķes para uma ilustra√ß√£o do mecanismo de edi√ß√£o de genomas. O primeiro video (em ingl√™s) fala um pouco sobre os mecanismos gerais destas t√©cnicas. O segundo v√≠deo (tamb√©m em ingl√™s) ilustra o mecanismo baseado na CRISPR.

Referência:

Cong, Le, et al. “Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.”Science¬†339.6121 (2013): 819-823.

Hwang, Woong Y., et al. “Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.”¬†Nature biotechnology¬†31.3 (2013): 227-229.

O que é Biologia Sintética?

Este post deveria ser um dos primeiros artigos para um site que se diz especializado em biologia sint√©tica. Mas confesso para voc√™s que definir o que √© biologia sint√©tica, para mim, n√£o foi (√©) uma tarefa f√°cil. Como podem ser vistos nos posts no blog, existem v√°rios aspectos da synbio que permitem diferentes defini√ß√Ķes de acordo com o ponto de vista de quem est√° fazendo biologia sint√©tica. Por exemplo, um engenheiro interessado em criar dispositivos computacionais sint√©ticos em uma bact√©ria, ou um biotecn√≥logo interessado em produzir biocombust√≠veis ou um bi√≥logo querendo montar uma bact√©ria a partir de simples elementos qu√≠micos. Claramente, todas estas √°reas est√£o conectadas, mas criar uma defini√ß√£o que consiga embarcar todas as possibilidades n√£o √© trivial. Por isso, digo que este post √© org√Ęnico, que deve mudar √† medida que o meu conhecimento sobre o assunto se aprofunda.

Uma característica que une todos os biológos sintéticos é a vontade de tornar o processo de engenharia de sistemas biológicos mais fácil e confiável. Dentro desse contexto, existem quatro diferentes níveis de atuação da biologia sintética:

(i) partes biol√≥gicas: sendo o DNA a linguagem de programa√ß√£o, as partes biol√≥gicas s√£o uma sequ√™ncia de dados (AGCTA…) que possuem fun√ß√Ķes determinadas. Por exemplo, uma sequ√™ncia de DNA que faz a c√©lula mudar a cor de verde para amarelo. Estas partes s√£o descritas, catalogadas e respeitam determinado padr√£o f√≠sico de montagem (leia mais sobre os biobricks). Espera-se que com o tempo se possam descrever as caracter√≠sticas de in√ļmeras partes biol√≥gicas para serem utilizadas para a constru√ß√£o de dispositivos, sistemas,…. Essa √© uma das fun√ß√Ķes da Secret√°ria de Partes Biol√≥gicas Padr√£o do MIT.

(ii) dispositivos sintéticos: são compostos por partes biológicas capazes de processar sinais. Processam inputs em outputs. Para a construção de dispositivos robustos e eficientes são necessárias partes que funcionem de uma maneira previsível. Veja mais sobre dispositivos sintéticos.

(iii) sistemas sint√©ticos: s√£o um conjunto dispositivos capazes de captar sinais, processar informa√ß√Ķes e realizar fun√ß√Ķes determinadas, como por exemplo, uma c√©lula capaz de captar algum sinal do ambiente e decidir se ir√° realizar uma determinada fun√ß√£o como combater uma c√©lula tumoral, produzir determinado metab√≥lito etc.

(iv) por √ļtimo, existe a arquitetura sint√©tica de popula√ß√Ķes em que, por ex, cada microrganismo possui um dispositivo diferente, sendo necess√°rio que estes dispositivos trabalhem em conjunto para realizar determinada fun√ß√£o. Trabalhar em conjunto, como¬†uma popula√ß√£o que precisa trabalhar com sincronismo, √© o¬†caso dos osciladores. Para isso, √© necess√°rio dominar mecanismos robustos de comunica√ß√£o c√©lula-c√©lula.

A biologia sintética pode ser aplicada em praticamente todas áreas da biologia molecular, biotecnologia e engenharia genética. Porém existem algumas áreas que se destacam como sendo próprias da biologia sintética:

1. Construção de uma célula mínima: identificação das partes básicas para construção de uma célula.

2.  Reconstrução de células: tendo como objetivo central a construção de formas de vida artificiais a partir de elementos químicos.

3. Construção de novos códigos genéticos.

5. Constru√ß√£o de c√©lulas capazes de realizar fun√ß√Ķes diferentes daquelas encontradas na natureza, como a obten√ß√£o de novas rotas bioqu√≠micas de produ√ß√£o de novos compostos. .

Essa √ļltima, talvez seja a que mais tenha impacto nas nossas vidas cotidianas a curto-prazo, atrav√©s do desenvolvimento de rem√©dios mais baratos e com a produ√ß√£o de combust√≠veis e qu√≠micos utilizando recursos renov√°veis.

Dispositivos sintéticos: uma bactéria que conta!

ResearchBlogging.org

Para quem n√£o leu, antes de ler este post, vale a pena ler o post anterior do interruptor para entender alguns conceitos b√°sicos. Um contador √© um componente central para circuitos digitais e de computa√ß√£o que guarda (e √†s vezes mostra)¬†o n√ļmero de eventos ou processos que ocorreram.

Neste trabalho é descrita a construção de contadores sintéticos para bactérias. Após a construção de um dispositivo aparentemente simples, Friedland et al. (2009) sofisticam bastante a construção do regulador para garantir uma resposta (contagem) robusta.

O primeiro contador descrito pelo trabalho √© o¬†“contador riborregulado por uma cascada transcricional” (riboregulated transcriptional cascade counter). Ele conta pulsos de arabinose no meio de cultura utilizando como sinal uma prote√≠na luminescente (GFP). S√£o riborregulados porque o taRNA (controlado por um promotor sens√≠vel a arabinose) se liga a cr e impede a forma√ß√£o de um grampo (pareamento) entre RBS e cr. Dessa maneira,¬† permite o reconhecimento do RBS (s√≠tio de liga√ß√£o do ribossomo) pelo ribossomo e a tradu√ß√£o do gene (ver Figura abaixo). O interessante √© que a transcri√ß√£o do taRNA √© regulada por um promotor sens√≠vel a arabinose. Assim, no primeiro pulso de arabinose, ocorre a transcri√ß√£o de taRNA que permite a tradu√ß√£o da RNA polimerase T7. Ap√≥s o primeiro pulso a arabinose e taRNA s√£o degradados. No segundo pulso ocorre, da mesma maneira, a transcri√ß√£o da RNA polimerase T3 atrav√©s do promotor PT7 que √© especificamente reconhecido pela RNA polimerase T7. No terceiro pulso, ocorre tamb√©m atrav√©s da media√ß√£o de taRNA e da polimerase T3, a transcri√ß√£o de GFP. Dessa maneira, a bact√©ria responde aos 3 pulsos de arabinose com um sinal luminescente.

Porém foi verificado um vazamento de expressão de GFP nos pulsos intermediários, além disso, demonstrou-se que se o pulso de arabinose não é dado a uma intensidade e frequência corretas, o contador  não funciona direito. Isto provavelmente ocorre devido aos limites cinéticos intrínsecos envolvendo os tempos de transcrição e degradação de mRNA.

Por esse motivo, um segundo (e muito mais bacana) contador foi construído, chamado contador de cascada de DNA invertase (DNA invertase cascade counter). Que basicamente acoplou ao modelo anterior um controle de invertases na região promotora.

Uma invertase √© uma enzima muito interessante, as enzimas Cre, por ex., reconhecem determinadas sequ√™ncias de DNA que flanqueiam uma determinada regi√£o de DNA e invertem a orienta√ß√£o dessa regi√£o. Essa enzima √© utilizada para ativar os promotores atrav√©s da invers√£o de sua orienta√ß√£o (ver Figura abaixo). Com essa constru√ß√£o foi poss√≠vel obter um controle muito maior da express√£o de GFP, ocorrendo, ap√≥s o terceiro pulso, uma express√£o muito maior de GFP. Este contador agora √© muito mais robusto em rela√ß√£o¬†√† varia√ß√£o de tempo entre os pulsos de arabinose, podendo contar pulsos realizados em intervalos de tempo de 2 a 12 horas. Este novo dispositivo, al√©m de mostrar o sinal luminescente, grava a informa√ß√£o no DNA atrav√©s das recombina√ß√Ķes.

Os autores foram ainda mais longe, trocaram o promotor de sensibilidade a arabinose por promotores capazes de responder a diferentes sinais. Dessa maneira, o dispositivo pode ser programado para gravar e responder diferentes sinais na ordem desejada. Incrível!

Esse dispositivo gen√©tico pode ser programado para diferentes fun√ß√Ķes a fim de sincronizar diferentes sinais para uma determinada resposta. Dependendo dos sinais acoplados ao dispositivo, estes mecanimos podem ser utilizados para biosensores, biorremedia√ß√£o ou na medicina.

Friedland, A., Lu, T., Wang, X., Shi, D., Church, G., & Collins, J. (2009). Synthetic Gene Networks That Count Science, 324 (5931), 1199-1202 DOI: 10.1126/science.1172005

Revistas científicas de Biologia Sintética

H√°¬†alguns posts atr√°s eu reuni alguns laborat√≥rios de biologia sint√©tica espalhados pelo mundo. √Č muito bacana para saber quem √© quem nesse mundo cient√≠fico. Por√©m, para saber o que estas pessoas e outras pessoas andam pensando √© preciso ler o que eles publicam. Por isso, desta vez eu reuni as principais revistas de Biologia Sint√©tica.

Fica aí a dica: dar uma olhada nessas revistas todo mês para ver o que está acontecendo no mundo synbio!

Nature – Molecular Systems Biology

BMC Systems Biology

Springer – Systems and Synthetic Biology

Journal of Biological Engineering

PLoS – Computational Biology

Journal of the Royal Society – Focus on Systems Biology