Microalgas na Biologia Sintética
Na penúltima reunião do Clube de Biologia Sintética foi discutido em que pé andam as pesquisas envolvendo microalgas – uma das milagrosas fontes energia sustentável e fixação de CO2 – no contexto da Biologia Sintética. O apresentador da vez, João Molino, com base nos conhecimentos que vem adquirindo no seu doutorado na Farmácia (FCF) aqui na USP, nos deu um review dos trabalhos com microalgas usadas em Biologia Sintética, além de falar um pouco de como as microalgas são incríveis para converter energia solar em bioprodutos e – consequentemente – fixar CO2. Com isso ele sugere no final algumas oportunidades que poderíamos usar para projetos do iGEM do ano que vem.
Vídeo com “Pipotecnica”
Como tivemos problemas envolvendo a transmissão da reunião (que já era feita de maneira precária), resolvemos gravar novamente a apresentação, só que desta vez utilizando uma nova pirotecnia dos vídeos da internet, o Popcornmaker (veja mais sobre ele nessa palestra de 4min no TED). Junto ao vídeo irão aparecer muitos links e informações extras diretamente da wikipédia em inglês (nunca substimem a wikipédia em inglês!), portanto se quiser saber mais sobre alguma informação “ao vivo” durante o vídeo, cheque os links! [clique na imagem abaixo para ir ao vídeo em outra aba]
Anotações Pessoais
Apesar do custo/benefício das pesquisas de microalgas na indústria não ser muito bom – segundo o que o Mateus me contou outro dia – suas características são muito provocativas para serem usadas como solução ecológica para muitos problemas e melhorar bastante processos de produção de bioprodutos já existentes. Ela faz coisas simplesmente incríveis. Como o João mostra no vídeo, ela é campeã na produção de galões/acre de óleo, além de poder viver em ambientes completamente isolados, como em uma garrafa fechada por exemplo – diga aí, qual ser vivo que você encontra no seu dia a dia (sem contar microalgas né…) que consegue viver muito bem e por muito tempo num ambiente completamente fechado e sem ar! Ela também fixa CO2 que é uma beleza, produz hidrogênio (hidrogênio cara!) e ainda pode ser usada como biorremediador (e de fato é naturalmente) para limpar áreas contaminadas!
Além de ser muito interessante biotecnologicamente, as microalgas são um grande gargalo na biologia sintética devido à falta de BioBricks e de elementos de DNA padronizados, como suas sequências terminadoras. O que é bem legal para o Registry of Parts e para o iGEM: partes inéditas! O time do chile do iGEM deste ano foi um dos primeiros a conseguir transformar cianobactérias (“parentes” das microalgas) com sucesso utilizando BioBricks na competição, o que é um bom indício para se trabalhar com microalgas.
O Grande Desafio
Apesar disso tudo, trabalhar com microalgas é algo bem desafiador, muito por causa do item mais valioso que se tem em laboratório: tempo. Um processo inserção de vetor nas células que duraria apenas (no máximo!) 2 dias de trabalhando com E.coli, com nossas amigas verdinhas duraria cerca de uma a duas semanas (se não me engano, segundo o que o João me contou). Para se fazer um projeto desse tipo estaríamos um pouco limitados para o pouco tempo do iGEM, a não ser que nos organizássemos muito bem (ainda estamos trabalhando nesse quesito). Mas o interessante é que aparentemente elas são bem geneticamente estáveis quando se tratando do vetor inserido; pelo o que o João nos contou, algumas microalgas transformadas duram anos com o seu novo pedaço de DNA. O processo de transformação também é aparentemente tranquilo e sem muito mistério.
Seguindo com os nossos objetivos de criar um projeto para o iGEM, muitas ideias surgiram da potencialidade de trabalhar com microalgas. Particularmente, comecei a pensar num sistema em que as microalgas “alimentassem” uns extremófilos, para que eles produzissem um efeito desejado com suas habilidades únicas da natureza – habilidades extremas! Mas discorro sobre isso em futuros posts.
Referência Principal
Durante o vídeo, muitas referências interessantes apareceram com ajuda do Popcornmaker, mas a referência principal que guiou o overview que o João nos fez é essa aí embaixo:
- Wang B, Wang J, Zhang W, & Meldrum DR (2012). Application of synthetic biology in cyanobacteria and algae. Frontiers in microbiology, 3 PMID: 23049529
Secretaria de Partes Biológicas Padrão
Já comentei em posts anteriores sobre os Biobricks, as partes biológicas padrão da biologia sintética. Dentro desse contexto, foi fundado em 2003, no MIT, a Secretaria de Partes Biológicas Padrão (Registry of Standard Biological Parts) para depositar as partes genéticas utilizadas na montagem de dispositivos e sistemas sintéticos. A secretaria contém mais de 3400 partes que podem ser trocadas por inúmeros laboratórios cadastrados e espera-se que todos contribuam com dados e novas partes para melhorar o repositório.
A secretaria oferece muitos tipos de partes biológicas, incluindo plasmídeos, primers, promotores, domínios de proteínas, sítios de ligação de ribossomos, riborreguladores, genes repórteres e etc… (veja a lista).
Entre os objetivos de criação do Registro estão: (i) possibilitar a engenharia sistemática da biologia, (ii) promover o desenvolvimento transparente e aberto de ferramentas de engenharia biológica e (iii) para construir uma sociedade que, produtivamente e democraticamente, possa aplicar tecnologias biológicas.
Atualmente mais de 120 laboratórios do mundo inteiro pertencem à comunidade dos Biobricks. Este ano, o Laboratório de Bioprodutos da USP foi o primeiro laboratório do país a fazer parte dessa comunidade. Algumas das nossas construções genéticas já estão sendo feitas em formato biobrick para que possamos receber partes e contribuir com partes também. Na próxima segunda, receberemos uma das responsáveis pela Secretária, Meagan Lizarazo que irá dar uma palestra sobre biologia sintética, biobricks, iGEM e outros assuntos relacionados.
Não percam esta oportunidade!
BioBricks: fabricação de pequenos fragmentos de DNA
Este protocolo é utilizado para a fabricação de BioBricks pequenos, como promotores ou sítios de ligação do ribossomo (RBS). Para isso, utiliza o anelamento e extensão dos primers para criar um pequeno fragmento de DNA (~ 100 bp) utilizando Taq polimerase de alta fidelidade. O fragmento de DNA pode ser imediatamente utilizado em uma reação de clonagem utilizando TOPO-TA. Caso se deseje realizar uma etapa de digestão do fragmento de DNA, uma etapa de purificação de produto de PCR é necessária.
Materiais:
– Dois primers que se sobrepõe por ~20 bp.
Primer 1: 5′ ———————————– 3′
Primer 2: 3′ ———————————– 5′
– Mix para PCR Taq alta fidelidade
Método
1. Diluir os dois oligos a uma concentração de 25 μM utilizando H2O. Para primers maiores que 50-60 bp podem ocorrer problemas como erros e deleções, por isso, pode valer a pena incluir uma etapa de purificação extra PAGE (Invitrogen).
2. Misturar os reagentes em um tubo estéril de 0.6 mL:
- 9 μL PCR supermix
- 0.5 μL primer 1
- 0.5 μL primer 2
3. A reação de anelamento e extensão dos primers ocorrem no termociclador segundo o seguinte protocolo:
- 94°C por 5 mins
- 94°C por 30 seconds
- 55°C por 30 seconds (ou qualquer outra temperatura de anelamento)
- 72°C por 30 seconds
- Repita os passos 2-4 por 2-3 ciclos
- 72°C por 5 mins
4. Utilize 1μL de produto de PCR fresco (feito no mesmo dia) numa reação de clonagem com TOPO TA cloning.
Para desenhar um BioBrick por esse método não se esqueça de colocar o prefixo e sufixo dos BioBricks nos primers. Pronto, já descrevemos os protocolos para desenhar e montar um circuito sintético com promotores, RBS e genes.
Boa sorte e qualquer dúvida, por favor, pergunte!
Referências
Stemmer WP, Crameri A, Ha KD, Brennan TM, and Heyneker HL. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene 1995 Oct 16; 164(1) 49-53. pmid:7590320. PubMed HubMed PubGet [Stemmer-Gene-1995].
http://openwetware.org/wiki/Knight:Annealing_and_primer_extension_with_Taq_polymerase
BioBricks: juntando as peças
No post anterior comentei sobre os BioBricks, que são as partes padrão da biologia sintética adotada pelo iGEM e pelos pesquisadores envolvidos nessa comunidade. Nada mais são que fragmentos de DNA (codificadores para um gene, promotor, regulador…) que possuem extremidades iguais. Essas extremidades apresentam enzimas de restrição que facilitam a clonagem de outros fragmentos de DNA em paralelo (ver Figura), gerando componentes com as mesmas extremidades.
Prefixo Fragmento de DNA Sufixo
Com essa construção é possível inserir um fragmento de DNA anterior (na região chamada prefixo) ao seu inserto clonado ou posterior ao seu inserto clonado (na região chamada de sufixo). Para clonar um prefixo, por ex, o seu componente tem que ser digerido com EcoRI e XbaI e o prefixo digerido com EcoRI e SpeI. Ao ligarem-se os componentes (com uma enzima Ligase) ocorre a ligação dos sítios EcoRI e dos sítios XbaI e SpeI, que possuem extremidades compatíveis para a ligação, como mostrado na figura abaixo:
Este processo recria os sítios EcoRI e XbaI no começo do componente e cria um sítio não-digerível misturado de SpeI/XbaI no final da junção (entre os fragmentos de DNA). O componente continua a carregar os sítios SpeI e PstI no componente original na extremidade sufixo. Dessa maneira, é possível juntar dois BioBricks e um componente que mantêm o mesmo padrão de montagem.
Para mais detalhes consulte referência deste post escrita por Tom Knight, um dos idealizadores dos BioBricks: Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks.