Microalgas na Biologia Sintética

ResearchBlogging.orgNa pen√ļltima reuni√£o do Clube de Biologia Sint√©tica foi discutido em que p√© andam as pesquisas envolvendo microalgas – uma das milagrosas fontes energia sustent√°vel e fixa√ß√£o de CO2 – no contexto da Biologia Sint√©tica.¬†O apresentador da vez, Jo√£o Molino,¬†com base nos conhecimentos que vem adquirindo no seu doutorado na Farm√°cia (FCF) aqui na USP, nos deu¬†um review dos trabalhos com microalgas usadas em Biologia Sint√©tica, al√©m de falar um pouco de como as microalgas s√£o incr√≠veis para converter energia solar em bioprodutos e – consequentemente – fixar CO2. Com isso ele sugere no final algumas oportunidades que poder√≠amos usar para projetos do iGEM do ano que vem.

V√≠deo com “Pipotecnica”

Como tivemos problemas envolvendo a transmiss√£o da reuni√£o (que j√° era feita de maneira prec√°ria), resolvemos gravar novamente a apresenta√ß√£o, s√≥ que desta vez utilizando uma nova pirotecnia dos v√≠deos da internet, o Popcornmaker (veja mais sobre ele nessa palestra de 4min no TED). Junto ao v√≠deo ir√£o aparecer muitos links e informa√ß√Ķes extras diretamente da wikip√©dia em ingl√™s (nunca substimem a wikip√©dia em ingl√™s!), portanto se quiser saber mais sobre alguma informa√ß√£o “ao vivo” durante o v√≠deo, cheque os links!¬†[clique na imagem abaixo para ir ao v√≠deo em outra aba]

Anota√ß√Ķes Pessoais

Apesar do custo/benef√≠cio das pesquisas de microalgas na ind√ļstria n√£o ser muito bom – segundo o que o Mateus¬†me contou outro dia – suas caracter√≠sticas s√£o muito provocativas para serem usadas como solu√ß√£o ecol√≥gica para muitos problemas e melhorar bastante processos de produ√ß√£o de bioprodutos j√° existentes. Ela faz coisas simplesmente incr√≠veis. Como o Jo√£o mostra no v√≠deo, ela √© campe√£ na produ√ß√£o de gal√Ķes/acre de √≥leo, al√©m de poder viver em ambientes completamente isolados, como em uma garrafa fechada por exemplo – diga a√≠, qual ser vivo que voc√™ encontra no seu dia a dia (sem contar microalgas n√©…) que consegue viver muito bem e por muito tempo num ambiente completamente fechado e sem ar! Ela tamb√©m fixa CO2 que √© uma beleza, produz hidrog√™nio (hidrog√™nio cara!) e ainda pode ser usada como biorremediador (e de fato √© naturalmente) para limpar √°reas contaminadas!

Al√©m de ser muito interessante biotecnologicamente, as microalgas s√£o um grande gargalo na biologia sint√©tica devido √† falta de BioBricks e de elementos de DNA padronizados, como suas sequ√™ncias terminadoras. O que √© bem legal para o Registry of Parts e para o iGEM: partes in√©ditas! O time do chile do iGEM deste ano foi um dos primeiros a conseguir transformar cianobact√©rias (“parentes” das microalgas) com sucesso utilizando BioBricks na competi√ß√£o, o que √© um bom ind√≠cio para se trabalhar com microalgas.

O Grande Desafio

Apesar disso tudo, trabalhar com microalgas é algo bem desafiador, muito por causa do item mais valioso que se tem em laboratório: tempo. Um processo inserção de vetor nas células que duraria apenas (no máximo!) 2 dias de trabalhando com E.coli, com nossas amigas verdinhas duraria cerca de uma a duas semanas (se não me engano, segundo o que o João me contou). Para se fazer um projeto desse tipo estaríamos um pouco limitados para o pouco tempo do iGEM, a não ser que nos organizássemos muito bem (ainda estamos trabalhando nesse quesito). Mas o interessante é que aparentemente elas são bem geneticamente estáveis quando se tratando do vetor inserido; pelo o que o João nos contou, algumas microalgas transformadas duram anos com o seu novo pedaço de DNA. O processo de transformação também é aparentemente tranquilo e sem muito mistério.

Seguindo com os nossos objetivos de criar um projeto para o iGEM, muitas ideias surgiram da potencialidade de trabalhar com microalgas. Particularmente, comecei a pensar num sistema em que as microalgas “alimentassem” uns extrem√≥filos, para que eles produzissem um efeito desejado com suas habilidades √ļnicas da natureza – habilidades extremas! Mas discorro sobre isso em futuros posts.

Referência Principal

Durante o vídeo, muitas referências interessantes apareceram com ajuda  do Popcornmaker, mas a referência principal que guiou o overview que o João nos fez é essa aí embaixo:

  • Wang B, Wang J, Zhang W, & Meldrum DR (2012). Application of synthetic biology in cyanobacteria and algae. Frontiers in microbiology, 3 PMID: 23049529

Secretaria de Partes Biológicas Padrão

J√° comentei em posts anteriores sobre os Biobricks, as partes biol√≥gicas padr√£o da biologia sint√©tica. Dentro desse contexto, foi fundado em 2003, no MIT,¬†a Secretaria de Partes Biol√≥gicas Padr√£o (Registry of Standard Biological Parts) para depositar as partes gen√©ticas utilizadas na montagem de dispositivos e sistemas sint√©ticos. A secretaria cont√©m mais de 3400 partes que podem ser trocadas por in√ļmeros laborat√≥rios cadastrados e espera-se que todos contribuam com dados e novas partes para melhorar o reposit√≥rio.

A secretaria oferece muitos tipos de partes biol√≥gicas, incluindo plasm√≠deos, primers, promotores, dom√≠nios de prote√≠nas, s√≠tios de liga√ß√£o de ribossomos, riborreguladores, genes rep√≥rteres e etc… (veja a lista).

Entre os objetivos de criação do Registro estão: (i) possibilitar a engenharia sistemática da biologia, (ii) promover o desenvolvimento transparente e aberto de ferramentas de engenharia biológica e (iii) para construir uma sociedade que, produtivamente e democraticamente, possa aplicar tecnologias biológicas.

Atualmente mais de 120 laborat√≥rios do mundo inteiro pertencem¬†√† comunidade dos Biobricks. Este ano, o Laborat√≥rio de Bioprodutos da USP foi o primeiro laborat√≥rio do pa√≠s a¬†fazer parte dessa comunidade. Algumas das nossas constru√ß√Ķes gen√©ticas j√°¬† est√£o sendo feitas em formato biobrick para que possamos receber partes e contribuir com partes tamb√©m. Na pr√≥xima segunda, receberemos uma das respons√°veis pela Secret√°ria, Meagan Lizarazo que ir√° dar uma palestra sobre biologia sint√©tica, biobricks, iGEM e outros assuntos relacionados.

N√£o percam esta oportunidade!

BioBricks: fabricação de pequenos fragmentos de DNA

Este protocolo é utilizado para a fabricação de BioBricks pequenos, como promotores ou sítios de ligação do ribossomo (RBS). Para isso, utiliza o anelamento e extensão dos primers para criar um pequeno fragmento de DNA (~ 100 bp) utilizando Taq polimerase de alta fidelidade. O fragmento de DNA pode ser imediatamente utilizado em uma reação de clonagem utilizando TOPO-TA. Caso se deseje realizar uma etapa de digestão do fragmento de DNA, uma etapa de purificação de produto de PCR é necessária.

Materiais:

– Dois primers que se sobrep√Ķe por ~20 bp.

Primer¬†1: ¬†¬†¬†5′ ———————————– 3′
Primer¬†2: ¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†3′ ———————————– 5′

Mix para PCR Taq alta fidelidade

Método

1. Diluir os dois oligos a uma concentra√ß√£o de 25 őľM utilizando H2O. Para primers¬†maiores que 50-60¬†bp podem ocorrer problemas como erros e dele√ß√Ķes, por isso,¬†pode valer a pena incluir uma etapa de purifica√ß√£o extra PAGE (Invitrogen).

2. Misturar os reagentes em um tubo estéril de 0.6 mL:

  • 9 őľL PCR supermix
  • 0.5 őľL¬†primer 1
  • 0.5 őľL¬†primer 2

3. A reação de anelamento e extensão dos primers ocorrem no termociclador segundo o seguinte protocolo:

  1. 94¬įC¬†por 5 mins
  2. 94¬įC¬†por 30 seconds
  3. 55¬įC¬†por 30 seconds (ou qualquer outra temperatura de anelamento)
  4. 72¬įC¬†por 30 seconds
  5. Repita os passos 2-4 por 2-3 ciclos
  6. 72¬įC¬†por 5 mins

4. Utilize 1őľL de produto de PCR fresco (feito no mesmo dia) numa rea√ß√£o de clonagem com TOPO TA cloning.

Para desenhar um BioBrick por esse método não se esqueça de colocar o prefixo e sufixo dos BioBricks nos primers. Pronto, já descrevemos os protocolos para desenhar e montar um circuito sintético com promotores, RBS e genes.

Boa sorte e¬†qualquer d√ļvida, por favor, pergunte!

Referências

Stemmer WP, Crameri A, Ha KD, Brennan TM, and Heyneker HL. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene 1995 Oct 16; 164(1) 49-53. pmid:7590320. PubMed HubMed PubGet [Stemmer-Gene-1995].

http://openwetware.org/wiki/Knight:Annealing_and_primer_extension_with_Taq_polymerase

BioBricks: juntando as peças

No post anterior comentei sobre os BioBricks, que s√£o as partes padr√£o da biologia sint√©tica adotada pelo iGEM e pelos pesquisadores envolvidos nessa comunidade. Nada mais s√£o que fragmentos de DNA (codificadores para um gene, promotor, regulador…) que possuem extremidades iguais. Essas extremidades apresentam enzimas de restri√ß√£o que facilitam a clonagem de¬†outros fragmentos de DNA em paralelo (ver Figura), gerando componentes com as mesmas extremidades.

Prefixo                  Fragmento de DNA               Sufixo

Com  essa construção é possível inserir um fragmento de DNA anterior (na região chamada prefixo) ao seu inserto clonado ou posterior ao seu inserto clonado (na região chamada de sufixo). Para clonar um prefixo, por ex, o seu componente tem que ser digerido com EcoRI e XbaI e o prefixo digerido com EcoRI e SpeI. Ao ligarem-se os componentes (com uma enzima Ligase) ocorre a ligação dos sítios EcoRI e dos sítios XbaI e SpeI, que possuem extremidades compatíveis para a ligação, como mostrado na figura abaixo:

Este processo recria os sítios EcoRI e XbaI no começo do componente e cria um sítio não-digerível misturado de SpeI/XbaI no final da junção (entre os fragmentos de DNA). O componente continua a carregar os sítios SpeI e PstI no componente original na extremidade sufixo. Dessa maneira, é possível juntar dois BioBricks e um componente que mantêm o mesmo padrão de montagem.

Para mais detalhes consulte referência deste post escrita por Tom Knight, um dos idealizadores dos BioBricks: Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks.