BioBricks: fabricação de pequenos fragmentos de DNA

Este protocolo é utilizado para a fabricação de BioBricks pequenos, como promotores ou sítios de ligação do ribossomo (RBS). Para isso, utiliza o anelamento e extensão dos primers para criar um pequeno fragmento de DNA (~ 100 bp) utilizando Taq polimerase de alta fidelidade. O fragmento de DNA pode ser imediatamente utilizado em uma reação de clonagem utilizando TOPO-TA. Caso se deseje realizar uma etapa de digestão do fragmento de DNA, uma etapa de purificação de produto de PCR é necessária.

Materiais:

– Dois primers que se sobrep√Ķe por ~20 bp.

Primer¬†1: ¬†¬†¬†5′ ———————————– 3′
Primer¬†2: ¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†3′ ———————————– 5′

Mix para PCR Taq alta fidelidade

Método

1. Diluir os dois oligos a uma concentra√ß√£o de 25 őľM utilizando H2O. Para primers¬†maiores que 50-60¬†bp podem ocorrer problemas como erros e dele√ß√Ķes, por isso,¬†pode valer a pena incluir uma etapa de purifica√ß√£o extra PAGE (Invitrogen).

2. Misturar os reagentes em um tubo estéril de 0.6 mL:

  • 9 őľL PCR supermix
  • 0.5 őľL¬†primer 1
  • 0.5 őľL¬†primer 2

3. A reação de anelamento e extensão dos primers ocorrem no termociclador segundo o seguinte protocolo:

  1. 94¬įC¬†por 5 mins
  2. 94¬įC¬†por 30 seconds
  3. 55¬įC¬†por 30 seconds (ou qualquer outra temperatura de anelamento)
  4. 72¬įC¬†por 30 seconds
  5. Repita os passos 2-4 por 2-3 ciclos
  6. 72¬įC¬†por 5 mins

4. Utilize 1őľL de produto de PCR fresco (feito no mesmo dia) numa rea√ß√£o de clonagem com TOPO TA cloning.

Para desenhar um BioBrick por esse método não se esqueça de colocar o prefixo e sufixo dos BioBricks nos primers. Pronto, já descrevemos os protocolos para desenhar e montar um circuito sintético com promotores, RBS e genes.

Boa sorte e¬†qualquer d√ļvida, por favor, pergunte!

Referências

Stemmer WP, Crameri A, Ha KD, Brennan TM, and Heyneker HL. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene 1995 Oct 16; 164(1) 49-53. pmid:7590320. PubMed HubMed PubGet [Stemmer-Gene-1995].

http://openwetware.org/wiki/Knight:Annealing_and_primer_extension_with_Taq_polymerase

BioBricks: juntando as peças

No post anterior comentei sobre os BioBricks, que s√£o as partes padr√£o da biologia sint√©tica adotada pelo iGEM e pelos pesquisadores envolvidos nessa comunidade. Nada mais s√£o que fragmentos de DNA (codificadores para um gene, promotor, regulador…) que possuem extremidades iguais. Essas extremidades apresentam enzimas de restri√ß√£o que facilitam a clonagem de¬†outros fragmentos de DNA em paralelo (ver Figura), gerando componentes com as mesmas extremidades.

Prefixo                  Fragmento de DNA               Sufixo

Com  essa construção é possível inserir um fragmento de DNA anterior (na região chamada prefixo) ao seu inserto clonado ou posterior ao seu inserto clonado (na região chamada de sufixo). Para clonar um prefixo, por ex, o seu componente tem que ser digerido com EcoRI e XbaI e o prefixo digerido com EcoRI e SpeI. Ao ligarem-se os componentes (com uma enzima Ligase) ocorre a ligação dos sítios EcoRI e dos sítios XbaI e SpeI, que possuem extremidades compatíveis para a ligação, como mostrado na figura abaixo:

Este processo recria os sítios EcoRI e XbaI no começo do componente e cria um sítio não-digerível misturado de SpeI/XbaI no final da junção (entre os fragmentos de DNA). O componente continua a carregar os sítios SpeI e PstI no componente original na extremidade sufixo. Dessa maneira, é possível juntar dois BioBricks e um componente que mantêm o mesmo padrão de montagem.

Para mais detalhes consulte referência deste post escrita por Tom Knight, um dos idealizadores dos BioBricks: Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks.

BioBricks: as partes biológicas padrão da biologia sintética.

Um objetivo subjacente da biologia sint√©tica √© tornar o processo de engenharia de sistemas biol√≥gicos mais f√°cil. Dentro desse processo, tem-se procurado desenvolver e definir partes biol√≥gicas padr√£o, para garantir que as pe√ßas biol√≥gicas produzidas possam ser montadas com facilidade e trocadas entre os bi√≥logos sint√©ticos pelo mundo de uma forma unificada e organizada. Assim, as partes biol√≥gicas padr√£o s√£o sequ√™ncias de √°cidos nucl√©icos que codificam para uma fun√ß√£o biol√≥gica que foram refinadas para se adequar a algum padr√£o t√©cnico de montagem definido. Nesse sentido, um paralelo interessante pode ser feito com um circuito el√©trico, em que os seus componentes (ex. diodo, resist√™ncia, interruptores, tomadas,…) precisam ter o mesmo tipo de conex√£o para poderem ser montados na sua casa, apesar de serem produzidos¬†por fabricantes diferentes.

O padrão técnico de composição física de montagem de peças biológicas que tem ganhado mais adeptos na comunidade de biologia sintética são os BioBricks, ou Biotijolos em português, desenvolvido pelo MIT. A inovação principal dos BioBricks é a padronização do modo de montagem dessas partes padrão: de maneira que a montagem de dois BioBricks resulta em um objeto que também é um BioBrick e pode ser combinado com qualquer outro BioBrick (ver mais detalhes na Figura).

Utilizando apenas 2 pares de enzimas, pode-se montar diferentes componentes em paralelo (DNA assembly) gerando extremidades que ainda podem receber outros componentes. Dessa maneira, pode-se juntar genes, reguladores de transcrição e tradução, promotores e qualquer outra peça biológica, para formar novos circuitos biológicos.