CRISPR: nova e revolucionária técnica para edição de genoma


nature_genomeedit
Ter o genoma sequenciado por apenas 1000 dólares em breve será uma realidade. E não é somente ler o genoma que está se tornando cada vez mais acessível, descobertas recentes resultaram em uma nova ferramenta de edição de genoma que promete revolucionar a pesquisa médica e o tratamento de algumas doenças. Este mecanismo, chamado de CRISPR, é baseado num sistema de defesa contra vírus, uma espécie de sistema imunológico, encontrado em bactérias. E mais uma aprendemos algo interessante com estes seres unicelulares (discutimos num post anterior como bactérias podem ajudar a combater o cancer).

Editando o genoma para curar doenças

Tornar o tratamento de desordens gen√©ticas √© sem d√ļvida uma das mais excitantes possibilidades desta nova t√©cnica, principalmente disordens causadas por uma ou poucas muta√ß√Ķes, tais como doen√ßa de¬†Huntington. Para comprovar que isto pode ser feito, cientistas do MIT, em experimentos em camundongos, conseguiram curar em uma doen√ßa rara que ataca o f√≠gado e √© causado pela muta√ß√£o de apenas um par de base de DNA. Esta doen√ßa, que tamb√©m ocorre em humanos, afeta 1 em cada 100.000 pessoas e consiste na falha da quebra do amino√°cido tirosina que acumula e afeta o funcionamento do f√≠gado. Utilizando a t√©cnica de CRISPR os cientistas conseguiram corrigir o gene para 1 em cada 250 c√©lulas do figado (hepat√≥citos) dos camundongos. Depois de 30 dias estas c√©lulas proliferaram e substituiram parte das c√©lulas com o gene defeituoso chegando a um ter√ßo da popula√ß√£o total de c√©lulas, o que foi suficiente para curar a doen√ßa. Veja o artigo publicado na Nature.

Mecanismo básico das ferramentas de edição de genoma

crisprBasicamente, o mecanismo de edição de genoma consiste em um sistema para reconhecer o sítio onde haverá a mudança combinado a um mecanismo de corte do DNA (nucleases). Uma vez reconhecido o local de corte as nucleases agem fazendo um corte nas duas fitas do DNA. Uma vez cortado, mecanismos de reparação do genoma tendem a juntar as fitas novamente e neste processo um pedaço de DNA pode ser removido ou até mesmo trocado por outro pedaço de DNA.

As primeiras técnicas desenvolvidas, tanto Zinc finger nucleases quanto TALEN, utilizam proteínas para reconhecer o sítio de corte no genoma. Proteínas são pesadas e díficeis de projetar, diferentemente de RNA que pode ser facilmente sintetizado. E é aí que está a grande inovação da técnica de CRISPR, em utilizar pequenos pedaços de RNA para identificar o sítio de corte, o que torna a técnica simples e de baixo custo.

Recomendo os seguintes v√≠deos/anima√ß√Ķes para uma ilustra√ß√£o do mecanismo de edi√ß√£o de genomas. O primeiro video (em ingl√™s) fala um pouco sobre os mecanismos gerais destas t√©cnicas. O segundo v√≠deo (tamb√©m em ingl√™s) ilustra o mecanismo baseado na CRISPR.

Referência:

Cong, Le, et al. “Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.”Science¬†339.6121 (2013): 819-823.

Hwang, Woong Y., et al. “Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.”¬†Nature biotechnology¬†31.3 (2013): 227-229.

Modelagem em biologia (sintética), um guia para ateus em modelagem.

Para uma pessoa que lida diariamente com biologia, pode ser bastante difícil imaginar uma maneira de abordar matematicamente um problema em sua área ou como isto poderia ter alguma utilidade. A biologia é uma ciência considerada bastante complexa, pois são muitas as variáveis que podem afetar o sistema. Até mesmo um sistema relativamente simples como a expressão de uma proteína em E. coli, pode se tornar um problema bastante complexo de se modelar se todas as variáveis que afetam a expressão desta proteína forem levadas em consideração. Na realidade, não há nem mesmo quem seja capaz de listar todas estas variáveis. Assim sendo, como é possível fazer um modelo disto, se não consigo nem mesmo listar as variáveis que alteram meu sistema? Neste caso, melhor mesmo fazer como o Calvin e ser um ateu em modelagem, não é mesmo?

Na verdade não, fazer um modelo não é tão complicado assim. Pensar que é necessário colocar tudo no modelo é o erro conceitual mais comum de quem tem formação em áreas complexas como a biologia. Já os físicos por exemplo, tem uma visão dita reducionista, de tentar entender um problema dividindo-o em pequenas partes fundamentais e começar pelo modelo mais simples possível para depois aumentar a complexidade, se necessário (ou possível). Reza a lenda que um dono galinheiro certa vez chamou um fisico para solucionar o porquê as galinhas não estavam botando. Uma semana depois o fisico apareceu com a solução. Entretanto, a solução só era válida para galinhas esfericamente simétricas e no vácuo. True story!

Pode parecer contradit√≥rio, mas um modelo que leva mais vari√°veis em considera√ß√£o n√£o necessariamente √© melhor ou mais “realistico”. Na verdade se um modelo leva mais vari√°veis em considera√ß√£o do que outro e ambos tem a mesma efeci√™ncia, o segundo modelo √© considerado melhor, conforme veremos.

Portanto, o melhor caminho para fazer um bom modelo é considerar as poucas e relevantes variáveis do problema, ou seja, ao fazer um modelo, a principal regra é:

Keep it simple, stupid!!
Este √© o famoso princ√≠pio KISS, uma boa regra para come√ßar um modelo. A maioria dos modelos funcionam melhor e s√£o melhor entendidos se mantidos simples. Complexidade desnecess√°ria deve ser evitada, mas obviamente, simplicidade demasiada n√£o deve resultar em um modelo √ļtil (como no caso das galinhas). Assim, uma boa maneira de se come√ßar um modelo √© pensar quais s√£o as vari√°veis que devem ser realmente importantes para o problema. Tente formular seu modelo com o m√≠nimo de vari√°veis e veja se seus resultados condizem com o esperado, ou com os experimentos. Se isto n√£o ocorrer, √© um sinal de que seu modelo ou √© demasiadamente simples e voc√™ esqueceu alguma vari√°vel muito importante ou voc√™ pode ter feito hip√≥teses que n√£o sejam v√°lidas. Fazer hip√≥teses condizentes n√£o √© uma tarefa na simples e exige um conhecimento profundo do problema em quest√£o.

O principio KISS é um conceito bastante semelhante à famosa navalha de Occam. Este princípio, introduzido por William Occam diz:

“Se em tudo o mais forem id√™nticas as v√°rias explica√ß√Ķes de um fen√īmeno, a mais simples √© a melhor.”

 

Exemplo

Para exemplificar o que foi dito, vamos brincar de modelar com um simples exemplo que discutimos certa vez em nosso grupo.

O problema consiste em estimar a concentração de uma proteína (nosso caso era a Cre recombinase) dentro das bactérias E.coli, ou seja, quantas Cre-recombinases existem, em média, por bactéria? Esta inferência é base para estimar o PoPS (veja post anterior)

Este parece ser um problema simples mas pode se tornar bastante complicado de resolver caso o princípio KISS não seja utilizado. Quem é importante neste problema? Devo considerar a temperatura? Devo considerar a quantidade de alimento no meio?

Você pode pensar, e com razão, que a temperatura e a quantidade de alimento são importantes pois afetam a taxa de produção das proteínas. Entretanto estes são exemplos de variáveis que não precisam
ser levados em considera√ß√£o pois, nos experimentos n√£o trabalharemos com situa√ß√Ķes extremas de escassez de alimento nem de mudan√ßas de temperatura e pequenas varia√ß√Ķes destas vari√°veis (fora de um regime extremo) n√£o devem afetar significantemente a produ√ß√£o da prote√≠na. Muitas s√£o as vari√°veis que n√£o afetam significamente o sistema e ter intui√ß√£o disto √© fundamental e repito, exige um bom entendimento do problema.

OK, mas por onde começar?

Bom, sabemos que para se produzir uma proteína primeiramente precisamos da produção do RNA mensageiro. A quantidade de mRNA certamente é uma variável relevante!!!
Portanto, vamos tentar criar uma equação sobre como o mRNA deve variar no tempo. A variação temporal de uma variável é representada matematicamente pela derivada da variável no tempo  

Sabemos que nosso mRNA deve ser produzido pela leitura do DNA, feita pela DNA polimerase. OK, mas com que velocidade ela lê isto? Uma boa referencia, é o Bionumbers (tipo um google para dados biológicos)

Lá encontramos que nossa taxa de transcrição (Ktrans) é de, em média, 40 pares de base por segundo. Mas então precisamos saber qual o tamanho do RNA que gera nossa proteína. No caso da Cre é de 1032 pares de base (Nbp). Portanto, quantidade de proteína produzida por tempo e por volume (V) é de:

Dividimos pelo volume pois queremos saber a variação de concentração, ou seja, quantidade de proteínas por volume (unidade em Molar). Este será o primeiro termo de nossa equação, que se refere a produção do mRNA. Existem outras maneiras dele ser produzido? Se sim, novos termos devem ser adicionados. Neste caso, aparentemente esta é a unica forma dele ser produzido. Mas ele pode ser degradado, não é mesmo? Então precisamos de mais um termo, o de degradação. Novamente se formos até o bionumbers teremos a taxa de degradação (KdRNA) do mRNA. Este novo termo fará com que a taxa do mRNA diminua no tempo, e por este motivo ele é negativo. Portanto nossa equação fica:

Onde o termo positivo se refere a produção e o negativo se refere a degradação.

Agora vamos escrever uma equação para a tradução do mRNA em proteína. Neste caso encontramos uma taxa de tradução de 15 aminoacidos por segundo. Como nossa proteina tem 1032 pares de base ela deve ter 1032/3=344 aminoacidos. Como, além de produzida, nossa proteína também pode ser degradada então temos uma equação bastante semelhate à anterior:

Podemos supor que inicialmente a concentração desta proteína é zero, isto não fará diferença nos cálculos mas suponhamos que não haja proteina inicialmente. Ao longo do tempo, a concentração
desta prote√≠na ir√° crescer at√© alcan√ßar o equilibrio entre produ√ß√£o e degrada√ß√£o. Neste equilibrio, a concentra√ß√£o das prote√≠nas n√£o mudam mais no tempo e portanto nossas equa√ß√Ķes s√£o iguais a zero. Para entender o equilibrio, pense na equa√ß√£o logistica que descreve a curva de crescimento de uma popula√ß√£o de bact√©rias. Inicialmente temos um crescimento exponencial, mas depois de um tempo a popula√ß√£o satura, ou seja, estabiliza em uma determinada popula√ß√£o. Este ponto de satura√ß√£o √© que chamamos de ponto de equilibrio, onde a quantidade de bact√©rias n√£o muda mais no tempo. Neste ponto, a quantidade de bact√©rias que morrem √© proporcional √†s que “nascem”. Matematicamente o ponto de equilibrio √© um ponto onde a derivada no tempo √© igual a zero, portanto:

ou seja:

e

Agora podemos isolar a concentração do mRNA na primeira equação e substituir na segunda. Com isto, chegamos a:

Qual o sentido deste valor? Bem voc√™ pode utilizar o volume da bact√©ria e calcular qual a concentra√ß√£o de uma √ļnica prote√≠na dentro de uma bact√©ria e voc√™ chegar√° que isto √© aproximadamente 1 nM. Portanto, nosso resultado nos diz que h√° aproximadamente 2.000 prote√≠nas, em m√©dia, dentro da bact√©ria.

OK, isto quer dizer que se eu fizer um experimento eu vou encontrar exatamente 2000 proteínas dentro da bactéria?

Obviamente n√£o, devemos ter em mente a limita√ß√£o de nosso modelo. Aproxima√ß√Ķes foram feitas e h√° muitas vari√°veis que podem fazer com que este valor mude. Entretanto, podemos dizer com certa seguran√ßa que teriamos algo de 1.000 √† 10.000 prote√≠nas na bact√©ria. Pode parecer muito inexato e que nosso modelo n√£o foi t√£o √ļtil por n√£o ser preciso. Mas devemos lembrar que inicialmente n√£o t√≠nhamos nenhuma ideia de quantas prote√≠nas haviam. Se algu√©m chutasse que h√° somente 10 ou 100 prote√≠nas em m√©dia poderiamos pensar que era uma estimativa boa. Com o modelo sabemos que esta estimativa n√£o¬†√© boa, que devem haver bem mais prote√≠nas que isto!

Al√©m da quantidade de prote√≠na, com este simples modelo poderiamos estimar o tempo que demora para que a quantidade de prote√≠na sature, ou seja, atinja o ponto de equilibrio. Estas s√£o estimativas que podem ser muito √ļteis na hora de definir um protocolo experimental e pode economizar uma razo√°vel quantidade de tempo e reagentes durante os experimentos.¬† Portanto, n√£o √© necess√°rio de ser ateu em modelagem, mas, tampouco, √© recomendado acreditar religiosamente no modelo!!

Clube de Biologia Sintética 2012

Come√ßaremos novamente nesta quarta feira (15 de agosto) as reuni√Ķes do Clube de Biologia Sint√©tica!

Não importa a área: se você se interessar por biotecnologia, pesquisa interdisciplinar, gosta de aprender coisas novas e de resolver desafios, está mais que convidado!

Você de Exatas

No Clube voc√™ pode descobrir um novo mundo para “programar”, modelar e resolver problemas utilizando conceitos de engenharia para se fazer o design de sistemas biol√≥gicos.
NOTA: Nesse ano colocamos um Físico em um laboratório de Biologia Molecular; foi mais ou menos assim:
[youtube_sc url=”http://www.youtube.com/watch?v=3drspKkfIyE”]

Você de Biológicas

Nas reuni√Ķes voc√™ pode descobrir que a Biologia pode ser muito mais exata do que voc√™ conhece, e a diferen√ßa √© s√≥ de abordagem.

E qual o Objetivo de Tudo Isso!?

Usar criatividade, interdisciplinariedade e empreendedorismo para esboçar um projeto para a competição internacional de máquinas geneticamente modificadas de 2013! E se divertir no processo, é claro!

A ideia √© gerar propostas para serem apresentadas nas reuni√Ķes √† partir de brainstormmings e refer√™ncias indicadas por qualquer participante do grupo. √Č uma oportunidade de se aprender a como se iniciar um projeto do zero, planejar experimentos, verificar viabilidades, procurar materiais, custos, buscar financiamento, organizar pessoas, tempo e recursos; ou seja: tudo o que voc√™ precisa para se dar bem em qualquer empreendimento.

J√° temos um pequeno cronograma¬†ainda com detalhes a definir, mas com temas j√° escolhidos. Depois disso quem far√° as reuni√Ķes ser√£o os pr√≥prios participantes, convidados a apresentar suas ideias, assuntos interessantes e relevantes de synbio e qualquer outra coisa que se encaixe na reuni√£o.

Nosso projeto para o iGEM 2012 ainda não acabou, mas vamos trazer toda a experiência que estamos acumulando para melhorar ainda mais ano que vem!

Horário: Das 18:30 às 20:00 hrs

Local: Sala “Fava Netto”, do ICB II – USP.

Vamos transmitir a reuni√£o por Livestream. Colocaremos o link no facebook, twitter e aqui no blog quando iniciarmos a transmiss√£o. Fiquem ligados!

Scinamate Synthetic Biology

Vídeo legal sobre SynBio

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ACS Synthetic Biology

A American Chemical Society anunciou o lançamento de uma nova
revista de artigos cient√≠ficos (revisada por pares), a ACS Synthetic Biology. O editor-chefe ser√° o Christopher A. Voigt, do MIT, e a revista publicar√° artigos de pesquisas de alta qualidade, cartas, notas t√©cnicas, tutoriais e revis√Ķes que nos far√£o entender melhor a organiza√ß√£o e a fun√ß√£o das c√©lulas, tecidos e organismos em seus sistemas. A revista √© particularmente interessada em estudos do design e s√≠ntese de novos circuitos gen√©ticos e produtos g√™nicos; m√©todos computacionais para o design de sistemas; e abordagens integrativas e aplicadas para o entendimento de doen√ßas e metabolismo. A revista come√ßar√° a aceitar submiss√Ķes em julho deste ano.

Alguns dos tópicos incluem * :

  • Design e otimiza√ß√£o de sistemas g√™nicos
  • Design de circuitos g√™nicos e seus princ√≠pios para sua organiza√ß√£o em programas
  • M√©todos computacionais para ajudar no design de sistemas g√™nicos
  • M√©todos experimentais para quantificar partes gen√©ticas, circuitos e fluxos metab√≥licos
  • Bibliotecas de partes gen√©ticas: sua cria√ß√£o, an√°lise, e representa√ß√£o ontol√≥gica
  • Engenharia de prote√≠nas incluindo o design computacional
  • Engenharia metab√≥lica e produ√ß√£o celular, incluindo convers√£o de biomassa
  • Engenharia e produ√ß√£o de produtos naturais
  • Aplica√ß√Ķes inovadoras e criativas de programa√ß√£o celular
  • Aplica√ß√Ķes m√©dicas, engenharia de tecidos, e a programa√ß√£o de c√©lulas terap√™uticas
  • Design e constru√ß√£o da ‚Äúc√©lula m√≠nima‚ÄĚ
  • Engenharia viral
  • Metodologias de s√≠ntese de DNA
  • Biologia de Sistemas e m√©todos para integrar m√ļltiplos dados

*(veja a lista completa no site, que não se limita aos tópicos mencionados)

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Biologia sintética e a computação

ResearchBlogging.org

Ontem¬†tivemos nossa primeira reuni√£o do Clube Cient√≠fico de¬†Biologia¬†Sint√©tica¬†para¬†discutir o artigo “Synthetic biology: new engineering¬†rules for an emerging disciplines.”¬†¬†A imagem abaixo resume¬†bastante a¬†abordagem dos autores do Departamento de Engenharia El√©trica Princeton para conduzir a revis√£o sobre o assunto.

Os autores tra√ßam um paralelo entre a biologia e os computadores, no qual, n√£o apenas se procura explicar a biologia celular utilizando a computa√ß√£o como analogia, mas tamb√©m, mostra que j√° foram desenvolvidos componentes biol√≥gicos que funcionam como componentes de computadores. S√£o dados exemplos de v√°rias constru√ß√Ķes biol√≥gicas sint√©ticas que¬†funcionam como componentes¬†el√©tricos, como¬†inversores (inverters devices), flip-flops (toggle-swicthes), osciladores (oscilators), amplificadores de¬†sinais (transcriptonal cascades modules) e¬†desviadores de sinais (diverter scaffolds). Restando assim,¬†poucos m√≥dulos para se construir um microcomputador celular sint√©tico.

Os autores comentam como estes¬†m√≥dulos sint√©ticos¬†e¬†a condi√ß√£o end√≥gena celular influenciam o comportamento um do outro,¬† sendo que qualquer flutua√ß√£o nos processos da c√©lula hospedeira podem influenciar o m√≥dulo e sua reposta (output). Dessa maneira, torna-se necess√°rio¬†combinar t√©cnicas de estima√ß√£o de par√Ęmetros¬†e t√©cnicas de an√°lises de fluxos metab√≥licos para entender o contexto celular e os impactos desses m√≥dulos na c√©lula.¬†Para explicar isto de uma maneira¬†resumida, a conectividade dos m√≥dulos entre si e com a c√©lula n√£o √© suficiente para definir a din√Ęmica de uma rede, √© preciso tamb√©m incluir par√Ęmetros cin√©ticos e regulat√≥rios (velocidade das rea√ß√Ķes, feedbacks, efeito de reguladores…) que podem variar sua atividade de acordo com as mudan√ßas realizadas no sistema original. Estes c√°lculos, por√©m,¬†s√£o muitos complicados e demandam uma mat√©matica muito avan√ßada. O que demonstra, mais uma vez, a necessidade de equipes multidisciplinares para a forma√ß√£o de grupos de pesquisa em synbio.

O artigo¬†mostra tamb√©m que c√©lulas sint√©ticas est√£o se tornando cada vez mais f√°ceis de construir. N√£o s√≥ pela nossa capacidade de manipular os componentes celular, mas pelo aumento da nossa capacidade de sintetizar DNA. Existem por√©m, desafios e limita√ß√Ķes nos tipos de atividades complexas que uma c√©lula independente consegue realizar de uma forma confi√°vel. Assim, uma nova fronteira para a synbio √© distribuir redes e m√≥dulos sint√©ticos entre m√ļltiplas c√©lulas, formando sistemas de comunica√ß√Ķes c√©lula-c√©lula, visando aumentar a possibilidade de desenhos e superar a confian√ßa limitada de c√©lulas sint√©ticas individuais. Para isso, j√° est√£o se desenvolvendo m√≥dulos de quorum sensing (mecanismos de comunica√ß√£o celular)¬†sint√©ticos que possibilitam a coordena√ß√£o do comportamento de comunidades microbianas. Verifica-se, portanto,¬†que muitos avan√ßos t√™m sido realizados para aumentar a complexidade da arquitetura das redes sint√©ticas.

Este artigo √© particularmente interessante porque mostra a vis√£o de¬†engenheiros el√©tricos do que √© a biologia sint√©tica. √Č importante destacar que existem diferentes vis√Ķes e abordagens de pesquisa¬†a respeito do que¬†√© a biologia sint√©tica e como ela pode ser aplicada, dependendo¬†da especialidade e background do grupo¬†de pesquisa.

Nas pr√≥ximas reuni√Ķes pretendemos abordar t√≥picos mais espec√≠ficos da¬†biologia sint√©tica, como a constru√ß√£o de um oscilador¬†sint√©tico, e mostrar diferentes vis√Ķes da biologia sint√©tica.

Até lá!

Andrianantoandro, E., Basu, S., Karig, D., & Weiss, R. (2006). Synthetic biology: new engineering rules for an emerging discipline Molecular Systems Biology, 2 DOI: 10.1038/msb4100073

BioBricks: fabricação de pequenos fragmentos de DNA

Este protocolo é utilizado para a fabricação de BioBricks pequenos, como promotores ou sítios de ligação do ribossomo (RBS). Para isso, utiliza o anelamento e extensão dos primers para criar um pequeno fragmento de DNA (~ 100 bp) utilizando Taq polimerase de alta fidelidade. O fragmento de DNA pode ser imediatamente utilizado em uma reação de clonagem utilizando TOPO-TA. Caso se deseje realizar uma etapa de digestão do fragmento de DNA, uma etapa de purificação de produto de PCR é necessária.

Materiais:

– Dois primers que se sobrep√Ķe por ~20 bp.

Primer¬†1: ¬†¬†¬†5′ ———————————– 3′
Primer¬†2: ¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†3′ ———————————– 5′

Mix para PCR Taq alta fidelidade

Método

1. Diluir os dois oligos a uma concentra√ß√£o de 25 őľM utilizando H2O. Para primers¬†maiores que 50-60¬†bp podem ocorrer problemas como erros e dele√ß√Ķes, por isso,¬†pode valer a pena incluir uma etapa de purifica√ß√£o extra PAGE (Invitrogen).

2. Misturar os reagentes em um tubo estéril de 0.6 mL:

  • 9 őľL PCR supermix
  • 0.5 őľL¬†primer 1
  • 0.5 őľL¬†primer 2

3. A reação de anelamento e extensão dos primers ocorrem no termociclador segundo o seguinte protocolo:

  1. 94¬įC¬†por 5 mins
  2. 94¬įC¬†por 30 seconds
  3. 55¬įC¬†por 30 seconds (ou qualquer outra temperatura de anelamento)
  4. 72¬įC¬†por 30 seconds
  5. Repita os passos 2-4 por 2-3 ciclos
  6. 72¬įC¬†por 5 mins

4. Utilize 1őľL de produto de PCR fresco (feito no mesmo dia) numa rea√ß√£o de clonagem com TOPO TA cloning.

Para desenhar um BioBrick por esse método não se esqueça de colocar o prefixo e sufixo dos BioBricks nos primers. Pronto, já descrevemos os protocolos para desenhar e montar um circuito sintético com promotores, RBS e genes.

Boa sorte e¬†qualquer d√ļvida, por favor, pergunte!

Referências

Stemmer WP, Crameri A, Ha KD, Brennan TM, and Heyneker HL. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene 1995 Oct 16; 164(1) 49-53. pmid:7590320. PubMed HubMed PubGet [Stemmer-Gene-1995].

http://openwetware.org/wiki/Knight:Annealing_and_primer_extension_with_Taq_polymerase