FAQ #6 Como ver se nossos plasmídeos incorporaram os pedacinhos de DNA?

FAQ da Bioengenharia 6

Sabendo o tamanho do plasmídeo e dos pedacinhos estimamos um tamanho para nosso novo plasmídeo e agora é só conferir se estão como esperado!

Para isso, existe uma t√©cnica de separa√ß√£o chamada eletroforese em gel, onde as mol√©culas s√£o ‚Äúpeneiradas‚ÄĚ por algum pol√≠mero (gel de poliacrilamida ou de agarose) quando se movimentam atra√≠das ou repulsadas pelos eletrodos de cargas opostas que s√£o colocados nas extremidades do gel. Ou seja, uma mol√©cula com carga negativa caminha para o eletrodo de carga positiva e vice-versa. E as mol√©culas de mesma carga correm de maneiras diferentes pelo gel de acordo com seus pesos moleculares e tamanhos, as menores e mais ‚Äúleves‚ÄĚ passam com mais facilidade pelo gel enquanto as maiores e mais ‚Äúpesadas‚ÄĚ ficam mais retidas.¬†No final, temos as mol√©culas separadas ao longo do gel e podemos comparar com a ladder (uma ‚Äúr√©gua‚ÄĚ feita de mol√©culas com pesos e tamanhos j√° conhecidos) para saber se nossos plasm√≠deos est√£o no tamanho esperado.

eletroforese2 eletroforese

Depois de confirmar pela eletroforese que nossos¬†plasm√≠deos foram modificados, precisamos ‚Äúsalv√°-los‚ÄĚ do gel para colocar nas c√©lulas. Basicamente, cortamos o peda√ßo de gel que est√° com nossos plasm√≠deos e colocamos em tubinhos com uma pequena coluna de s√≠lica dentro (imagem a√≠ embaixo). Ent√£o as mol√©culas de DNA se ligam √† coluna, fazemos uma lavagem para tirar o gel e depois dilu√≠mos o DNA para retir√°-lo da coluna!

 

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Para saber mais sobre eletroforese, assista o v√≠deo do JOVE Science¬†aqui¬†e purifica√ß√£o¬†aqui.¬†ūüôā

Por Otto Heringer e Viviane Siratuti.

FAQs da Bioengenharia РIntrodução

FAQ da Bioengenharia 1

Preocupados com os novos amantes da biologia sint√©tica, estamos procurando materiais de introdu√ß√£o no assunto e encontramos algumas coisas interessantes! ūüôā

Por isso vamos colocar uma sequ√™ncia de posts explicativos, partindo de uma vis√£o geral e seguindo por perguntas mais espec√≠ficas. √Č um pequeno tutorial-FAQ sobre alguns fundamentos que quando entendidos ajudam bastante a entender algumas de nossas discuss√Ķes e outros posts deste blog. Serve para ajudar principalmente quem n√£o √© da √°rea de biol√≥gicas ou quem ainda n√£o se aprofundou muito neste assunto! Se continuarem com d√ļvidas, perguntem t√°?!

Lembrem-se de ativar as legendas dos vídeos, caso necessitem! Todos possuem legendas originais em inglês e alguns em português. Você pode colocá-las traduzidas quando só houver em inglês (não muito recomendado, rs). Nos vídeos do JOVE existe a opção de colocar os textos em português. Se você não sabia que o YouTube fazia isso por você, dá uma olhada aqui (dica: barrinha inferior do vídeo).

Antes de mais nada, voc√™ sabe o que s√£o e quais as rela√ß√Ķes entre nossas principais mol√©culas org√Ęnicas (DNA, RNA e prote√≠nas), certo? Se sua resposta √© n√£o, assista um desses v√≠deos!

 

[youtube_sc url=”http://www.youtube.com/watch?v=h3b9ArupXZg#t=0″]

[youtube_sc url=”http://www.youtube.com/watch?v=tMr9XH64rtM”]

 

Indo além da Estrutura 

OK, agora vamos al√©m desses conceitos b√°sicos dos v√≠deos. Mais que entender a estrutura e a din√Ęmica dessas biom√≥leculas, como os cientistas a alteram? Em linhas gerais, como se faz para modificar geneticamente um organismo?

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Vamos l√°! Primeiro pegamos um pedacinho codificante de DNA (gene) de outro organismo que tenha certa caracter√≠stica que desejamos. Para isso, extra√≠mos o DNA e depois multiplicamos s√≥ esse peda√ßo que nos interessa atrav√©s de uma t√©cnica chamada PCR (afinal, a efici√™ncia das transforma√ß√Ķes √© pequena e quanto mais material melhor). Precisamos tamb√©m extrair e abrir os plasm√≠deos (DNA circular) do organismo escolhido para receber este gene e assim receber as novas caracter√≠sticas (j√° que¬†o plasm√≠deo √© nosso principal ve√≠culo de introdu√ß√£o dos genes nas c√©lulas). Para abrir estes plasm√≠deos usamos enzimas de restri√ß√£o que cortam as mol√©culas de DNA em lugares espec√≠ficos e chamamos isso de digest√£o. Depois que tivermos v√°rios plasm√≠deos e genes, podemos grud√°-los com a ajuda de enzimas de liga√ß√£o.¬†E ent√£o, para saber se nosso novo plasm√≠deo deu certo usamos uma t√©cnica de separa√ß√£o por carga e tamanho de mol√©cula, a eletroforese em gel. Nela, as mol√©culas se acumulam em certas posi√ß√Ķes que nos dizem seus tamanhos (mergulhadas em um pol√≠mero)¬†e assim podemos identificar aquelas que correspondem ao que estimamos. Al√©m disso, fazemos testes com a t√©cnica PCR e o sequenciamento gen√©tico. Se os testes disserem que tudo que fizemos deu certo, recuperamos o material e colocamos nossos novos plasm√≠deos nos organismos, geralmente utilizando choque t√©rmico ou el√©trico. Esse passo, introdu√ß√£o de plasm√≠deos, √© a chamada transforma√ß√£o. Mas para selecionarmos somente aqueles organismos que realmente foram transformados usamos antibi√≥ticos que matam as c√©lulas que n√£o ganharam os nossos novos plasm√≠deos, j√° que n√£o possuem os genes de resist√™ncia que foram colocados neles. E no final, cada c√©lula que sobreviveu se multiplicar√°, formando col√īnias de organismos geneticamente modificados. Agora d√° uma olhada no esquema de novo e v√™ se entendeu at√© aqui!

Por Otto Heringer e Viviane Siratuti.