FAQ #8 Como ver se a transformação gênica deu certo?

FAQ da Bioengenharia 8

Já colocamos nossos plasmídeos nos bichinhos, mas ainda não acabou. Essa é a hora de saber se tudo que fizemos até aqui deu certo!

Primeiro, colocamos eles na placa de seleção com antibiótico e só aqueles que realmente incorporaram o plasmídeo vão sobreviver porque ganharam um gene amigo de resistência ao antibiótico. Agora pegamos uma parte das células sobreviventes e fazemos um teste usando a PCR (você lembra dessa técnica, né?).
Como testar com a PCR?! Roubamos os plasmídeos dessas células e tentamos multiplicar o pedaço de DNA que foi grudado nele adicionando primers, nucleotídeos e enzimas sob aquecimento e desaquecimento. Se o nosso plasmídeo modificado tiver sido incorporado pelos micro-organismos haverá a multiplicação do pedacinho e podemos vê-los em uma eletroforese. Caso contrário, nada foi copiado e nada vai aparecer na eletroforese. Então temos o sinal de que alguma coisa não deu certo por aqui e as chances de erros deste teste são bem pequenas.

Depois vamos para um teste melhor ainda, o sequenciamento. Este teste diz exatamente qual √© a sequ√™ncia de pares de base da mol√©cula do plasm√≠deo e acabam de vez suas d√ļvidas se a transforma√ß√£o deu certo ou n√£o! O sequenciamento come√ßa parecendo um processo de duplica√ß√£o normal de DNA. Mas al√©m de cadeias molde, enzimas e nucleot√≠deos normais, h√° nucleot√≠deos especiais sintetizados (ddNTP’s) que possuem duas boas propriedades: emitem luz e interrompem o prologamento da cadeia a partir de onde foram adicionados. Ent√£o, imagine uma mol√©cula de DNA que possui um par de base A-T em um determinado comprimento e considere que a base A pertence √† cadeia molde e a base T √† cadeia complementar. Se esta base T for um nucleot√≠deo especial temos como identificar “quem √©” e “qual sua posi√ß√£o” na cadeia, pois ele emitir√° uma cor espec√≠fica para Timina e o comprimento de sua cadeia est√° interrompido na posi√ß√£o exata (n¬ļ 2 em verde).¬†Sequenciamento de DNAPodemos detectar a cor emitida atrav√©s de um espectr√≥grafo e a posi√ß√£o pelo tamanho revelado na eletroforese em gel (o sequenciador √© basicamente a uni√£o dos dois). Ou detectar o tipo de nucleot√≠deo presente n√£o pela cor, mas colocando os filamentos “lavados” por cada tipo de nucleot√≠deo em po√ßos diferentes do gel e interpretando a sequ√™ncia a olho nu/manualmente.¬†Depois de identificado o nucleot√≠deo da cadeia complementar √© poss√≠vel saber quem ocupa a mesma posi√ß√£o na cadeia molde, no caso citado √© a base Adenina.¬†Expanda esse racioc√≠nio para todas as outras bases da mol√©cula, com uma amostra grande teremos cadeias de todos os comprimentos poss√≠veis, interrompidas por um dos 4 tipos de nucleot√≠deos especiais (A, T, C, G), e assim √© poss√≠vel sequenciar toda a mol√©cula de DNA!

dna2

Para saber mais sobre sequenciamento genético, clique aqui.

Por Otto Heringer e Viviane Siratuti.

 

FAQ #3 Como copiar o código em laboratório?

FAQ da Bioengenharia 3

Ah√°! Essa √© a pergunta que mudou a biotecnologia. At√© conseguirmos fazer isso, n√≥s (i.e. humanidade) passamos por um caminho bem interessante¬†envolvendo pr√™mios nobel e momentos epif√Ęnicos. O videozinho¬†explica muito melhor do que esse texto corrido como funciona a metodologia pra se fazer isso, a Rea√ß√£o em Cadeia da Polimerase (Polimerase Chain Reaction), o t√£o amado e odiado (quando simplesmente n√£o funciona) PCR!

[youtube_sc url=”http://www.youtube.com/watch?v=vmlLj1aLZ7s”]

Encurtando a hist√≥ria: usando uma enzima que trabalha ‚Äúsentando‚ÄĚ no molde de uma fita √ļnica de DNA, aquecimento e desaquecimento (para ‚Äúligar‚ÄĚ e ‚Äúdesligar‚ÄĚ essa enzima) e pedacinhos de nucleot√≠deo, conseguimos fazer milh√Ķes de c√≥pias de apenas uma √ļnica mol√©cula de DNA – √© por isso que o pessoal do CSI (o seriado) consegue uma grande informa√ß√£o gen√©tica usando apenas res√≠duos quase desprez√≠veis de material biol√≥gico.

 pcr

Por Otto Heringer e Viviane Siratuti.

FAQs da Bioengenharia РIntrodução

FAQ da Bioengenharia 1

Preocupados com os novos amantes da biologia sint√©tica, estamos procurando materiais de introdu√ß√£o no assunto e encontramos algumas coisas interessantes! ūüôā

Por isso vamos colocar uma sequ√™ncia de posts explicativos, partindo de uma vis√£o geral e seguindo por perguntas mais espec√≠ficas. √Č um pequeno tutorial-FAQ sobre alguns fundamentos que quando entendidos ajudam bastante a entender algumas de nossas discuss√Ķes e outros posts deste blog. Serve para ajudar principalmente quem n√£o √© da √°rea de biol√≥gicas ou quem ainda n√£o se aprofundou muito neste assunto! Se continuarem com d√ļvidas, perguntem t√°?!

Lembrem-se de ativar as legendas dos vídeos, caso necessitem! Todos possuem legendas originais em inglês e alguns em português. Você pode colocá-las traduzidas quando só houver em inglês (não muito recomendado, rs). Nos vídeos do JOVE existe a opção de colocar os textos em português. Se você não sabia que o YouTube fazia isso por você, dá uma olhada aqui (dica: barrinha inferior do vídeo).

Antes de mais nada, voc√™ sabe o que s√£o e quais as rela√ß√Ķes entre nossas principais mol√©culas org√Ęnicas (DNA, RNA e prote√≠nas), certo? Se sua resposta √© n√£o, assista um desses v√≠deos!

 

[youtube_sc url=”http://www.youtube.com/watch?v=h3b9ArupXZg#t=0″]

[youtube_sc url=”http://www.youtube.com/watch?v=tMr9XH64rtM”]

 

Indo além da Estrutura 

OK, agora vamos al√©m desses conceitos b√°sicos dos v√≠deos. Mais que entender a estrutura e a din√Ęmica dessas biom√≥leculas, como os cientistas a alteram? Em linhas gerais, como se faz para modificar geneticamente um organismo?

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Vamos l√°! Primeiro pegamos um pedacinho codificante de DNA (gene) de outro organismo que tenha certa caracter√≠stica que desejamos. Para isso, extra√≠mos o DNA e depois multiplicamos s√≥ esse peda√ßo que nos interessa atrav√©s de uma t√©cnica chamada PCR (afinal, a efici√™ncia das transforma√ß√Ķes √© pequena e quanto mais material melhor). Precisamos tamb√©m extrair e abrir os plasm√≠deos (DNA circular) do organismo escolhido para receber este gene e assim receber as novas caracter√≠sticas (j√° que¬†o plasm√≠deo √© nosso principal ve√≠culo de introdu√ß√£o dos genes nas c√©lulas). Para abrir estes plasm√≠deos usamos enzimas de restri√ß√£o que cortam as mol√©culas de DNA em lugares espec√≠ficos e chamamos isso de digest√£o. Depois que tivermos v√°rios plasm√≠deos e genes, podemos grud√°-los com a ajuda de enzimas de liga√ß√£o.¬†E ent√£o, para saber se nosso novo plasm√≠deo deu certo usamos uma t√©cnica de separa√ß√£o por carga e tamanho de mol√©cula, a eletroforese em gel. Nela, as mol√©culas se acumulam em certas posi√ß√Ķes que nos dizem seus tamanhos (mergulhadas em um pol√≠mero)¬†e assim podemos identificar aquelas que correspondem ao que estimamos. Al√©m disso, fazemos testes com a t√©cnica PCR e o sequenciamento gen√©tico. Se os testes disserem que tudo que fizemos deu certo, recuperamos o material e colocamos nossos novos plasm√≠deos nos organismos, geralmente utilizando choque t√©rmico ou el√©trico. Esse passo, introdu√ß√£o de plasm√≠deos, √© a chamada transforma√ß√£o. Mas para selecionarmos somente aqueles organismos que realmente foram transformados usamos antibi√≥ticos que matam as c√©lulas que n√£o ganharam os nossos novos plasm√≠deos, j√° que n√£o possuem os genes de resist√™ncia que foram colocados neles. E no final, cada c√©lula que sobreviveu se multiplicar√°, formando col√īnias de organismos geneticamente modificados. Agora d√° uma olhada no esquema de novo e v√™ se entendeu at√© aqui!

Por Otto Heringer e Viviane Siratuti.

Problemas com PCR!

Ap√≥s desenhar o seu primer, ¬†montar a sua rea√ß√£o e programar o termociclador, voc√™ pode enfrentar problemas para otimizar as sua condi√ß√Ķes de PCR. Algumas simples a√ß√Ķes podem resultar em um produto de PCR espec√≠fico. Estas s√£o as quest√Ķes mais comuns aqui no laborat√≥rio:

1. Estou tendo (muitos) fragmentos inespecíficos maiores do que o esperado. O que fazer?

РDiminuir o tempo de anelamento da reação;

– Aumentar a temperatura de anelamento (aumento 2 graus a cada teste);

– Diminuir o tempo de extens√£o;

– Colocar menos primers;

– Checar e colocar menos DNA;

2. Estou obtendo fragmentos inespecíficos menores do que o esperado. O que fazer?

– Aumentar a temperatura de anelamento;

– Aumentar o tempo de anelamento;

– Aumentar a temperatura de extens√£o;

– Aumentar a temperatura de extens√£o para 74-78 oC;

– Colocar menos primers e/ou menos DNA.

3. A reação estava funcionando antes, mas agora eu não obtenho nenhum produto.

– Tenha certeza que todos os componentes est√£o na rea√ß√£o (tamp√£o, DNA, primers…);

РTeste um novo Master Mix ou uma nova solução de dNTP (são sensíveis a descongelamentos consecutivos);

– Utilize um estoque novo de primers;

– Diminua sua temperatura de anelamento 6-10 oC, se n√£o obtiver nenhum fragmento verifique todas os componentes.

Nos pr√≥ximos posts vou comentar sobre t√©cnicas de PCR: como RT-PCR, dele√ß√£o de genes…

Como desenhar um primer? E como montar uma reação de PCR?

No post passado eu comentei sobre a técnica de PCR e de como programar um PCR. Neste post eu vou um pouco mais adiante e vou falar sobre como desenhar um iniciador (primer) e como montar uma reação de PCR.

O desenho do primer tem que ser feito com muito cuidado para garantir o futuro do projeto, erros no desenho podem ser percebidos apenas muito tempo depois, após muito esforço e dinheiro já ter sido gasto no projeto. Por isso, realize essa tarefa com muito cuidado, tendo em vista todo o projeto.

A primeira coisa √© pegar a sequ√™ncia de interesse no GenBank, como¬†por exemplo para o gene codificador da enzima xilose isomerase de Escherichia coli. Conhe√ßa o gene, busque artigos sobre ele, veja os genes que est√£o envolta, como ele √© regulado,… Depois salve a sequ√™ncia do gene e mais ou menos 200 bp envolta dele em um documento word. Encontre o start c√≥don, o stop c√≥don, promotor,… e decida a sua estrat√©gia de clonagem.

Para desenhar primers para amplificar¬†o gene inteiro voc√™ precisar√° de regi√Ķes envolta do gene. Al√©m disso existem uma s√©rie de regras a que voc√™ precisa ficar atento para desenhar o primer como: composi√ß√£o de G-C, tamanho do primer, temperatura de anelamento, forma√ß√£o de d√≠meros e estruturas secund√°rias e muito mais. Para este trabalho, eu recomendo utilizar um software, o FastPCR. Um software livre (gratuito) e amig√°vel.

√Č preciso apenas colocar a sua sequ√™ncia de interesse e pedir para que ele desenhe os primers, depois voc√™ precisa checar se aquela sequ√™ncia amplifica a sua regi√£o de interesse.¬†Para a encontrar o primer reverso¬†na sua sequ√™ncia tem uma ferramenta para obter o reverso¬†complementar da sequ√™ncia, j√° que as sequencias de primers s√£o dadas no sentido 5¬ī – 3¬ī.

Finalmente, voc√™ pode fazer um PCR in silico, para isso, volte¬†para o Genbank e copie¬†toda a sequ√™ncia do genoma¬†da bact√©ria desejada (isso pode¬†demorar alguns minutos) e¬†passe para o FastPCR para fazer o PCR in silico com os primers desenhados. Com isso, voc√™ pode verificar poss√≠veis regi√Ķes amplificadas pelo seu par de¬†primers.

Depois de mandar sintetizar os primers, voc√™ pode fazer um programa como¬†mostrado no post anterior. Para a rea√ß√£o PCR voc√™ deve seguir o protocolo da sua Taq polimerase comprada. Vale a pena ressaltar que para amplifica√ß√Ķes de genes que ser√£o expressos posteriormente, recomendo uma Taq polimerase de alta fidelidade.

No pr√≥ximo post vou comentar sobre erros e solu√ß√Ķes comuns que ocorrem com rea√ß√Ķes de PCR.

O que é um PCR? Como montar um programa de PCR?

Polymerase chain reaction ou rea√ß√£o da polimerase em cadeia (PCR) √© t√©cnica de biologia molecular utilizada para amplificar (aumentar o n√ļmero) de um ou de alguns peda√ßos de DNA em v√°rias ordens de magnitude, gerando milh√Ķes de c√≥pias de uma sequ√™ncia particular de DNA.

Utilizando um termociclador (aparelho que permite mudan√ßas r√°pidas de temperatura), uma DNA polimerase, um par de iniciadores (primers) e dNTP¬īs (deoxinucleot√≠deos, que formar√£o a nova mol√©cula de DNA) √© poss√≠vel sintetizar in vitro DNA a partir de uma fita molde. ¬†Veja o v√≠deo no youtube.

Diz a lenda que Kary Mullis teve a idéia do PCR em um daqueles momentos de ócio produtivo enquanto surfava nas ondas do Sul da Califórnia. Um ano mais tarde, 1983, a sua idéia virou realidade através do desenvolvimento da primeira máquina de PCR. Dez anos mais tarde, 1993, Mullis também foi surfar após receber a notícia que havia sido ganhador do prêmio Nobel pela sua invenção. Essa é uma ótima desculpa para não trabalhar aos finais de semana no laboratório! (rs)

A partir do programa de PCR b√°sico¬†abaixo¬†√© poss√≠vel desenhar um programa espec√≠fico para seu iniciador e fragmento a ser amplificado. No passo (step) 2, ocorre a denatura√ß√£o do DNA, No passo 3, ocorre a liga√ß√£o do iniciador ao seu DNA, para isso √© preciso calcular a temperatura de anelamento do seu iniciador. Existe um c√°lculo baseado na composi√ß√£o dos iniciadores (Ta = 2(A + T) + 4(C + G) – 5), mas existem alguns softwares que calculam para voc√™ (por√©m esta temperatura n√£o deve ser abaixo de 50oC, para evitar liga√ß√Ķes inespec√≠ficas). Ap√≥s a liga√ß√£o dos iniciadores ao DNA, ir√° ocorrer a s√≠ntese de DNA pela DNA Polimerase, normalmente se utiliza a Taq polimerase que possui uma temperatura ideal de 72oC. O tempo de elongamento da sua sequ√™ncia depende do tamanho dela, calcula-se cerca de 1 min para cada 1000 pares de base (n√£o menos de 30 segundos). Finalmente, este ciclo ser√° repetido 30 vezes.

Programa b√°sico de PCR:

Step ¬† ¬† ¬† ¬† Temperature (¬įC) ¬† ¬† ¬†Time (min)

1                     95                                    2:00

2                     95                                    0:30

3                     55                                    0:30

4                    72                                      1:00

5                    Go to step 3,                    30 times

6                     4                                        forever

No próximo post vou comentar sobre o desenho de iniciadores (primers) e como montar uma reação de PCR!