Portas Lógicas em Sistemas Gênicos

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A associa√ß√£o da biologia sint√©tica com a eletr√īnica √© bem grande. A semelhan√ßa entre a intera√ß√£o de enzimas, fatores de transcri√ß√£o e DNA, e circuitos el√©tricos gera uma interessante conex√£o interdisciplinar entre engenharia el√©trica e biologia, tanto que os pr√≥prios fundadores do iGEM e do registry of parts s√£o engenheiros el√©tricos!

Algumas boas analogias, ou melhor, interpreta√ß√Ķes dos sistemas g√™nicos, s√£o feitas com o uso de portas l√≥gicas para classificar o comportamento das intera√ß√Ķes g√™nicas. Portas l√≥gicas baseiam-se na l√≥gica booleana, usada largamente em computa√ß√£o. Para entender melhor, vamos ver uns dois exemplos: o NOR e AND.

NOR¬†(“not OR”, o inverso do resultado para a porta OR, conhecido tamb√©m como NEM):

Imagem retirada e modificada da referência (Khalil, A., & Collins, J.).
 

Como j√° foi mostrado aqui no blog, esse dispositivo possui dois estados est√°veis que podem ser ligados ou desligados atrav√©s de inputs espec√≠ficos. Retirando esse input, no caso sinais ex√≥genos como calor e IPTG, o sistema preserva o seu estado, criando assim uma forma molecular n√£o exclusivamente estrutural (i.e. conforma√ß√£o de prote√≠nas e etc) de mem√≥ria na c√©lula. O racioc√≠nio √© o mesmo em eletr√īnica, como no circuito flip-flop¬†do tipo set-reset, que √© capaz de servir como uma mem√≥ria de um bit em circuitos digitais.

O sistema pode ser interpretado atrav√©s da tabela verdade de NOR: As entradas s√£o as intera√ß√Ķes (de repress√£o ou ativa√ß√£o) do sinal ex√≥geno e do produto g√™nico, enquanto os n√ļmeros 0 e 1 associados √† falso e verdadeiro, podem ser interpretados respectivamente como repress√£o e ativa√ß√£o nas colunas da entrada, e exist√™ncia (um) ou n√£o (zero) de
um output na coluna da sa√≠da. Ent√£o por exemplo, tendo A como o calor (heat) e B como a prote√≠na repressora Cl (produzida por cl-ts) s√≥ se ter√° uma sa√≠da (o n√ļmero 1), ou melhor, um estado est√°vel do toggle (em que √© expresso apenas um conjunto de genes), se houver uma intera√ß√£o entre repress√Ķes, ou seja, a repress√£o do repressor, no caso o calor reprimindo a repress√£o de Cl de lacl, que produz um estado est√°vel de produ√ß√£o de Ptrc2 e GFP (green flourescent protein). Para o outro estado est√°vel, com produ√ß√£o de Cl e repress√£o do gene lacl, a id√©ia √© a mesma, basta fazer A igual √† IPTG e B igual √† Ptrc2.

AND (conhecido também por E):

Imagem retirada e modificada da referência (Khalil, A., & Collins, J.).
 

Nesse exemplo, s√£o necess√°rios dois inputs para se obter o output: um de arabinose para transcrever a polimerase T7 com dois stop codons √Ęmbar (√© uma classe de stop codons, representada no desenho como pequeninos c√≠rculos vermelhos com pontas) no c√≥digo do seu gene (a polimerase √© necess√°ria para expressar o sinal de GFP); e outro sinal de salicilato que promove a transcri√ß√£o de supD, um RNA transportador supressor de stop codons √Ęmbar. Desse modo, tomando A da tabela verdade como a arabinose, e B como salicilato, pode-se ver claramente que apenas com a ativa√ß√£o da transcri√ß√£o feita por esses fatores a express√£o desses dois genes, pode ocorrer o output de luz fluorescente verde dada pela GFP: o produto de supD suprime os stop codons do gene t7pol, permitindo a transcri√ß√£o completa de polimerase T7.

Esse √© um exemplo de qu√£o sofisticado um sistema g√™nico pode ser ao se ligar a informa√ß√£o sensorial de m√ļltiplos elementos sensitivos a uma express√£o g√™nica programada. O interessante dessa interface entre engenharia el√©trica e microbiologia √© a possibilidade de constru√ß√£o de sistemas g√™nicos com o mesmo princ√≠pio de uma s√©rie de outros dispositivos j√° existentes na engenharia, e tamb√©m o contr√°rio: (porque n√£o!?) usar os dispositivos moleculares que a pr√≥pria natureza criou e aplic√°-los na eletr√īnica.

Para mais informa√ß√Ķes sobre outros sistemas bem interessantes, vale ver o review muito legal sobre biologia sint√©tica:

Khalil, A., & Collins, J. (2010). Synthetic biology: applications come of age Nature Reviews Genetics, 11 (5), 367-379 DOI: 10.1038/nrg2775

Dispositivos sintéticos: interruptores de expressão gênica

S√≥ agora tive tempo para fazer um post sobre a nossa segunda reuni√£o do Clube Cient√≠fico de Biologia Sint√©tica da USP que, com certeza, vai render alguns posts.¬†¬†Conversamos sobre¬†uma das¬†primeiras constru√ß√Ķes gen√©ticas de biologia sint√©tica visando a robustez no controle de express√£o: a constru√ß√£o de um interruptor gen√©tico (toggle switch, flip flop,..).¬†Robusto porque √© capaz de funcionar corretamente a partir do modelo apesar de v√°rias incertezas do sistema.

Mas para entender o dispositivo, vou comentar alguns conceitos b√°sicos de biologia molecular: (i) promotores s√£o regi√Ķes do DNA que antecedem os genes e¬†s√£o reconhecidas pela RNA polimerase e um fator sigma associado para facilitar a transcri√ß√£o do gene, (ii) transcri√ß√£o √© processo de cria√ß√£o de um RNA complementar¬†a sequ√™ncia de DNA que posteriormente pode ser traduzido por um ribossomo a uma prote√≠na, finalmente, (iii) um repressor √© uma prote√≠na de liga√ß√£o de DNA que regula a express√£o de genes, atrav√©s da liga√ß√£o a um operador, e bloqueia a liga√ß√£o da RNA polimerase¬†no promotor,¬†impedindo a transcri√ß√£o de genes.

Utilizando esses conceitos b√°sicos de biologia molecular, Gardner e colaboradores (2000) constru√≠ram um interruptor para regular a transcri√ß√£o de genes em E. coli.¬†Chama-se um interruptor porque possuiu dois pontos de equil√≠brio (acesso ou apagado, direita ou esquerda, express√£o de X ou express√£o de Y). Vou dar o exemplo de apenas uma das constru√ß√Ķes, em que o repressor 2 (repressor LacI) reprime o promotor 2 (Ptrc-2), e o repressor (repressor Tet) reprime o promotor 1 (PltetO-1).¬† A subst√Ęncia IPTG (Indutor 2) inibe o¬†repressor 2 e¬†aTC (Indutor 1) inibe o repressor 1 (ver Figura abaixo).

Dessa maneira, basicamente, temos dois pontos de equil√≠brio: (i) com¬†a presen√ßa de aTC,¬†o repressor 2¬†√© transcrito e ocorre a repress√£o do promotor 2, n√£o havendo assim¬†a transcri√ß√£o do gene rep√≥rter (no caso uma prote√≠na luminescente GFP); (ii) e na presen√ßa de IPTG em que ocorre a transcri√ß√£o do promotor¬†2, e conseq√ľente transcri√ß√£o de GFP e do repressor 1.

Dessa maneira, existem dois estágios: aceso (transcrição de GFP) e apagado (sem transcrição de GFP). Este sistema é robusto porque funciona de acordo com o modelo proposto:

Onde u √© a concentra√ß√£o do repressor 1, v √© a concentra√ß√£o do repressor 2, őĪ1 √© a taxa efetiva de transcri√ß√£o do repressor 1, őĪ2 √© a taxa efetiva de transcri√ß√£o do repressor 2, ő≤¬†√© taxa de cooperatividade da repress√£o do promotor 2 e ő≥ √© taxa cooperatividade de repress√£o do promotor 1.¬†A a√ß√£o deste modelo corresponde a seguinte estrutura gr√°fica:

Este gráfico representa os dois pontos de equilíbrio do sistema, o estado 1 e o estado 2 (aceso e apagado, na presença de um dos indutores) e um outro ponto instável de equílibrio que mostra os dois repressores se regulando mutuamente. Seria mais fácil de entender se houvesse, de uma lado uma proteína luminescente verde e  do outro lado do dispositivo uma proteína luminescente amarela. Os estados de equilibro 1 e 2 representam verde ou amarelo, enquanto o ponto instável de equilíbrio representa a ausência de cor.

Este tipo de dispositivo pode ser utilizado na biotecnologia para regular vias metabólicas inteiras, ligando e desligando vias de acordo com um sinal externo; ou na medicina para acionar a resposta a um remédio por exemplo. Funcionam de uma maneira mais eficiente do que o controle via promotores específicos. No próximo post, vou comentar a utilização desse dispositivo para desenvolver uma bactéria que conta!

Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Gardner TS, Cantor CR and Collins JJ. Nature 403: 339-342 (2000).