O que é um PCR? Como montar um programa de PCR?

Polymerase chain reaction ou rea√ß√£o da polimerase em cadeia (PCR) √© t√©cnica de biologia molecular utilizada para amplificar (aumentar o n√ļmero) de um ou de alguns peda√ßos de DNA em v√°rias ordens de magnitude, gerando milh√Ķes de c√≥pias de uma sequ√™ncia particular de DNA.

Utilizando um termociclador (aparelho que permite mudan√ßas r√°pidas de temperatura), uma DNA polimerase, um par de iniciadores (primers) e dNTP¬īs (deoxinucleot√≠deos, que formar√£o a nova mol√©cula de DNA) √© poss√≠vel sintetizar in vitro DNA a partir de uma fita molde. ¬†Veja o v√≠deo no youtube.

Diz a lenda que Kary Mullis teve a idéia do PCR em um daqueles momentos de ócio produtivo enquanto surfava nas ondas do Sul da Califórnia. Um ano mais tarde, 1983, a sua idéia virou realidade através do desenvolvimento da primeira máquina de PCR. Dez anos mais tarde, 1993, Mullis também foi surfar após receber a notícia que havia sido ganhador do prêmio Nobel pela sua invenção. Essa é uma ótima desculpa para não trabalhar aos finais de semana no laboratório! (rs)

A partir do programa de PCR b√°sico¬†abaixo¬†√© poss√≠vel desenhar um programa espec√≠fico para seu iniciador e fragmento a ser amplificado. No passo (step) 2, ocorre a denatura√ß√£o do DNA, No passo 3, ocorre a liga√ß√£o do iniciador ao seu DNA, para isso √© preciso calcular a temperatura de anelamento do seu iniciador. Existe um c√°lculo baseado na composi√ß√£o dos iniciadores (Ta = 2(A + T) + 4(C + G) – 5), mas existem alguns softwares que calculam para voc√™ (por√©m esta temperatura n√£o deve ser abaixo de 50oC, para evitar liga√ß√Ķes inespec√≠ficas). Ap√≥s a liga√ß√£o dos iniciadores ao DNA, ir√° ocorrer a s√≠ntese de DNA pela DNA Polimerase, normalmente se utiliza a Taq polimerase que possui uma temperatura ideal de 72oC. O tempo de elongamento da sua sequ√™ncia depende do tamanho dela, calcula-se cerca de 1 min para cada 1000 pares de base (n√£o menos de 30 segundos). Finalmente, este ciclo ser√° repetido 30 vezes.

Programa b√°sico de PCR:

Step ¬† ¬† ¬† ¬† Temperature (¬įC) ¬† ¬† ¬†Time (min)

1                     95                                    2:00

2                     95                                    0:30

3                     55                                    0:30

4                    72                                      1:00

5                    Go to step 3,                    30 times

6                     4                                        forever

No próximo post vou comentar sobre o desenho de iniciadores (primers) e como montar uma reação de PCR!