FAQ #8 Como ver se a transformação gênica deu certo?

FAQ da Bioengenharia 8

Já colocamos nossos plasmídeos nos bichinhos, mas ainda não acabou. Essa é a hora de saber se tudo que fizemos até aqui deu certo!

Primeiro, colocamos eles na placa de seleção com antibiótico e só aqueles que realmente incorporaram o plasmídeo vão sobreviver porque ganharam um gene amigo de resistência ao antibiótico. Agora pegamos uma parte das células sobreviventes e fazemos um teste usando a PCR (você lembra dessa técnica, né?).
Como testar com a PCR?! Roubamos os plasmídeos dessas células e tentamos multiplicar o pedaço de DNA que foi grudado nele adicionando primers, nucleotídeos e enzimas sob aquecimento e desaquecimento. Se o nosso plasmídeo modificado tiver sido incorporado pelos micro-organismos haverá a multiplicação do pedacinho e podemos vê-los em uma eletroforese. Caso contrário, nada foi copiado e nada vai aparecer na eletroforese. Então temos o sinal de que alguma coisa não deu certo por aqui e as chances de erros deste teste são bem pequenas.

Depois vamos para um teste melhor ainda, o sequenciamento. Este teste diz exatamente qual √© a sequ√™ncia de pares de base da mol√©cula do plasm√≠deo e acabam de vez suas d√ļvidas se a transforma√ß√£o deu certo ou n√£o! O sequenciamento come√ßa parecendo um processo de duplica√ß√£o normal de DNA. Mas al√©m de cadeias molde, enzimas e nucleot√≠deos normais, h√° nucleot√≠deos especiais sintetizados (ddNTP’s) que possuem duas boas propriedades: emitem luz e interrompem o prologamento da cadeia a partir de onde foram adicionados. Ent√£o, imagine uma mol√©cula de DNA que possui um par de base A-T em um determinado comprimento e considere que a base A pertence √† cadeia molde e a base T √† cadeia complementar. Se esta base T for um nucleot√≠deo especial temos como identificar “quem √©” e “qual sua posi√ß√£o” na cadeia, pois ele emitir√° uma cor espec√≠fica para Timina e o comprimento de sua cadeia est√° interrompido na posi√ß√£o exata (n¬ļ 2 em verde).¬†Sequenciamento de DNAPodemos detectar a cor emitida atrav√©s de um espectr√≥grafo e a posi√ß√£o pelo tamanho revelado na eletroforese em gel (o sequenciador √© basicamente a uni√£o dos dois). Ou detectar o tipo de nucleot√≠deo presente n√£o pela cor, mas colocando os filamentos “lavados” por cada tipo de nucleot√≠deo em po√ßos diferentes do gel e interpretando a sequ√™ncia a olho nu/manualmente.¬†Depois de identificado o nucleot√≠deo da cadeia complementar √© poss√≠vel saber quem ocupa a mesma posi√ß√£o na cadeia molde, no caso citado √© a base Adenina.¬†Expanda esse racioc√≠nio para todas as outras bases da mol√©cula, com uma amostra grande teremos cadeias de todos os comprimentos poss√≠veis, interrompidas por um dos 4 tipos de nucleot√≠deos especiais (A, T, C, G), e assim √© poss√≠vel sequenciar toda a mol√©cula de DNA!

dna2

Para saber mais sobre sequenciamento genético, clique aqui.

Por Otto Heringer e Viviane Siratuti.

 

O que é Biologia Sintética?

Este post deveria ser um dos primeiros artigos para um site que se diz especializado em biologia sint√©tica. Mas confesso para voc√™s que definir o que √© biologia sint√©tica, para mim, n√£o foi (√©) uma tarefa f√°cil. Como podem ser vistos nos posts no blog, existem v√°rios aspectos da synbio que permitem diferentes defini√ß√Ķes de acordo com o ponto de vista de quem est√° fazendo biologia sint√©tica. Por exemplo, um engenheiro interessado em criar dispositivos computacionais sint√©ticos em uma bact√©ria, ou um biotecn√≥logo interessado em produzir biocombust√≠veis ou um bi√≥logo querendo montar uma bact√©ria a partir de simples elementos qu√≠micos. Claramente, todas estas √°reas est√£o conectadas, mas criar uma defini√ß√£o que consiga embarcar todas as possibilidades n√£o √© trivial. Por isso, digo que este post √© org√Ęnico, que deve mudar √† medida que o meu conhecimento sobre o assunto se aprofunda.

Uma característica que une todos os biológos sintéticos é a vontade de tornar o processo de engenharia de sistemas biológicos mais fácil e confiável. Dentro desse contexto, existem quatro diferentes níveis de atuação da biologia sintética:

(i) partes biol√≥gicas: sendo o DNA a linguagem de programa√ß√£o, as partes biol√≥gicas s√£o uma sequ√™ncia de dados (AGCTA…) que possuem fun√ß√Ķes determinadas. Por exemplo, uma sequ√™ncia de DNA que faz a c√©lula mudar a cor de verde para amarelo. Estas partes s√£o descritas, catalogadas e respeitam determinado padr√£o f√≠sico de montagem (leia mais sobre os biobricks). Espera-se que com o tempo se possam descrever as caracter√≠sticas de in√ļmeras partes biol√≥gicas para serem utilizadas para a constru√ß√£o de dispositivos, sistemas,…. Essa √© uma das fun√ß√Ķes da Secret√°ria de Partes Biol√≥gicas Padr√£o do MIT.

(ii) dispositivos sintéticos: são compostos por partes biológicas capazes de processar sinais. Processam inputs em outputs. Para a construção de dispositivos robustos e eficientes são necessárias partes que funcionem de uma maneira previsível. Veja mais sobre dispositivos sintéticos.

(iii) sistemas sint√©ticos: s√£o um conjunto dispositivos capazes de captar sinais, processar informa√ß√Ķes e realizar fun√ß√Ķes determinadas, como por exemplo, uma c√©lula capaz de captar algum sinal do ambiente e decidir se ir√° realizar uma determinada fun√ß√£o como combater uma c√©lula tumoral, produzir determinado metab√≥lito etc.

(iv) por √ļtimo, existe a arquitetura sint√©tica de popula√ß√Ķes em que, por ex, cada microrganismo possui um dispositivo diferente, sendo necess√°rio que estes dispositivos trabalhem em conjunto para realizar determinada fun√ß√£o. Trabalhar em conjunto, como¬†uma popula√ß√£o que precisa trabalhar com sincronismo, √© o¬†caso dos osciladores. Para isso, √© necess√°rio dominar mecanismos robustos de comunica√ß√£o c√©lula-c√©lula.

A biologia sintética pode ser aplicada em praticamente todas áreas da biologia molecular, biotecnologia e engenharia genética. Porém existem algumas áreas que se destacam como sendo próprias da biologia sintética:

1. Construção de uma célula mínima: identificação das partes básicas para construção de uma célula.

2.  Reconstrução de células: tendo como objetivo central a construção de formas de vida artificiais a partir de elementos químicos.

3. Construção de novos códigos genéticos.

5. Constru√ß√£o de c√©lulas capazes de realizar fun√ß√Ķes diferentes daquelas encontradas na natureza, como a obten√ß√£o de novas rotas bioqu√≠micas de produ√ß√£o de novos compostos. .

Essa √ļltima, talvez seja a que mais tenha impacto nas nossas vidas cotidianas a curto-prazo, atrav√©s do desenvolvimento de rem√©dios mais baratos e com a produ√ß√£o de combust√≠veis e qu√≠micos utilizando recursos renov√°veis.

Problemas com PCR!

Ap√≥s desenhar o seu primer, ¬†montar a sua rea√ß√£o e programar o termociclador, voc√™ pode enfrentar problemas para otimizar as sua condi√ß√Ķes de PCR. Algumas simples a√ß√Ķes podem resultar em um produto de PCR espec√≠fico. Estas s√£o as quest√Ķes mais comuns aqui no laborat√≥rio:

1. Estou tendo (muitos) fragmentos inespecíficos maiores do que o esperado. O que fazer?

РDiminuir o tempo de anelamento da reação;

– Aumentar a temperatura de anelamento (aumento 2 graus a cada teste);

– Diminuir o tempo de extens√£o;

– Colocar menos primers;

– Checar e colocar menos DNA;

2. Estou obtendo fragmentos inespecíficos menores do que o esperado. O que fazer?

– Aumentar a temperatura de anelamento;

– Aumentar o tempo de anelamento;

– Aumentar a temperatura de extens√£o;

– Aumentar a temperatura de extens√£o para 74-78 oC;

– Colocar menos primers e/ou menos DNA.

3. A reação estava funcionando antes, mas agora eu não obtenho nenhum produto.

– Tenha certeza que todos os componentes est√£o na rea√ß√£o (tamp√£o, DNA, primers…);

РTeste um novo Master Mix ou uma nova solução de dNTP (são sensíveis a descongelamentos consecutivos);

– Utilize um estoque novo de primers;

– Diminua sua temperatura de anelamento 6-10 oC, se n√£o obtiver nenhum fragmento verifique todas os componentes.

Nos pr√≥ximos posts vou comentar sobre t√©cnicas de PCR: como RT-PCR, dele√ß√£o de genes…

Como desenhar um primer? E como montar uma reação de PCR?

No post passado eu comentei sobre a técnica de PCR e de como programar um PCR. Neste post eu vou um pouco mais adiante e vou falar sobre como desenhar um iniciador (primer) e como montar uma reação de PCR.

O desenho do primer tem que ser feito com muito cuidado para garantir o futuro do projeto, erros no desenho podem ser percebidos apenas muito tempo depois, após muito esforço e dinheiro já ter sido gasto no projeto. Por isso, realize essa tarefa com muito cuidado, tendo em vista todo o projeto.

A primeira coisa √© pegar a sequ√™ncia de interesse no GenBank, como¬†por exemplo para o gene codificador da enzima xilose isomerase de Escherichia coli. Conhe√ßa o gene, busque artigos sobre ele, veja os genes que est√£o envolta, como ele √© regulado,… Depois salve a sequ√™ncia do gene e mais ou menos 200 bp envolta dele em um documento word. Encontre o start c√≥don, o stop c√≥don, promotor,… e decida a sua estrat√©gia de clonagem.

Para desenhar primers para amplificar¬†o gene inteiro voc√™ precisar√° de regi√Ķes envolta do gene. Al√©m disso existem uma s√©rie de regras a que voc√™ precisa ficar atento para desenhar o primer como: composi√ß√£o de G-C, tamanho do primer, temperatura de anelamento, forma√ß√£o de d√≠meros e estruturas secund√°rias e muito mais. Para este trabalho, eu recomendo utilizar um software, o FastPCR. Um software livre (gratuito) e amig√°vel.

√Č preciso apenas colocar a sua sequ√™ncia de interesse e pedir para que ele desenhe os primers, depois voc√™ precisa checar se aquela sequ√™ncia amplifica a sua regi√£o de interesse.¬†Para a encontrar o primer reverso¬†na sua sequ√™ncia tem uma ferramenta para obter o reverso¬†complementar da sequ√™ncia, j√° que as sequencias de primers s√£o dadas no sentido 5¬ī – 3¬ī.

Finalmente, voc√™ pode fazer um PCR in silico, para isso, volte¬†para o Genbank e copie¬†toda a sequ√™ncia do genoma¬†da bact√©ria desejada (isso pode¬†demorar alguns minutos) e¬†passe para o FastPCR para fazer o PCR in silico com os primers desenhados. Com isso, voc√™ pode verificar poss√≠veis regi√Ķes amplificadas pelo seu par de¬†primers.

Depois de mandar sintetizar os primers, voc√™ pode fazer um programa como¬†mostrado no post anterior. Para a rea√ß√£o PCR voc√™ deve seguir o protocolo da sua Taq polimerase comprada. Vale a pena ressaltar que para amplifica√ß√Ķes de genes que ser√£o expressos posteriormente, recomendo uma Taq polimerase de alta fidelidade.

No pr√≥ximo post vou comentar sobre erros e solu√ß√Ķes comuns que ocorrem com rea√ß√Ķes de PCR.

O que é um PCR? Como montar um programa de PCR?

Polymerase chain reaction ou rea√ß√£o da polimerase em cadeia (PCR) √© t√©cnica de biologia molecular utilizada para amplificar (aumentar o n√ļmero) de um ou de alguns peda√ßos de DNA em v√°rias ordens de magnitude, gerando milh√Ķes de c√≥pias de uma sequ√™ncia particular de DNA.

Utilizando um termociclador (aparelho que permite mudan√ßas r√°pidas de temperatura), uma DNA polimerase, um par de iniciadores (primers) e dNTP¬īs (deoxinucleot√≠deos, que formar√£o a nova mol√©cula de DNA) √© poss√≠vel sintetizar in vitro DNA a partir de uma fita molde. ¬†Veja o v√≠deo no youtube.

Diz a lenda que Kary Mullis teve a idéia do PCR em um daqueles momentos de ócio produtivo enquanto surfava nas ondas do Sul da Califórnia. Um ano mais tarde, 1983, a sua idéia virou realidade através do desenvolvimento da primeira máquina de PCR. Dez anos mais tarde, 1993, Mullis também foi surfar após receber a notícia que havia sido ganhador do prêmio Nobel pela sua invenção. Essa é uma ótima desculpa para não trabalhar aos finais de semana no laboratório! (rs)

A partir do programa de PCR b√°sico¬†abaixo¬†√© poss√≠vel desenhar um programa espec√≠fico para seu iniciador e fragmento a ser amplificado. No passo (step) 2, ocorre a denatura√ß√£o do DNA, No passo 3, ocorre a liga√ß√£o do iniciador ao seu DNA, para isso √© preciso calcular a temperatura de anelamento do seu iniciador. Existe um c√°lculo baseado na composi√ß√£o dos iniciadores (Ta = 2(A + T) + 4(C + G) – 5), mas existem alguns softwares que calculam para voc√™ (por√©m esta temperatura n√£o deve ser abaixo de 50oC, para evitar liga√ß√Ķes inespec√≠ficas). Ap√≥s a liga√ß√£o dos iniciadores ao DNA, ir√° ocorrer a s√≠ntese de DNA pela DNA Polimerase, normalmente se utiliza a Taq polimerase que possui uma temperatura ideal de 72oC. O tempo de elongamento da sua sequ√™ncia depende do tamanho dela, calcula-se cerca de 1 min para cada 1000 pares de base (n√£o menos de 30 segundos). Finalmente, este ciclo ser√° repetido 30 vezes.

Programa b√°sico de PCR:

Step ¬† ¬† ¬† ¬† Temperature (¬įC) ¬† ¬† ¬†Time (min)

1                     95                                    2:00

2                     95                                    0:30

3                     55                                    0:30

4                    72                                      1:00

5                    Go to step 3,                    30 times

6                     4                                        forever

No próximo post vou comentar sobre o desenho de iniciadores (primers) e como montar uma reação de PCR!