Como desenhar um primer? E como montar uma reação de PCR?

No post passado eu comentei sobre a técnica de PCR e de como programar um PCR. Neste post eu vou um pouco mais adiante e vou falar sobre como desenhar um iniciador (primer) e como montar uma reação de PCR.

O desenho do primer tem que ser feito com muito cuidado para garantir o futuro do projeto, erros no desenho podem ser percebidos apenas muito tempo depois, após muito esforço e dinheiro já ter sido gasto no projeto. Por isso, realize essa tarefa com muito cuidado, tendo em vista todo o projeto.

A primeira coisa √© pegar a sequ√™ncia de interesse no GenBank, como¬†por exemplo para o gene codificador da enzima xilose isomerase de Escherichia coli. Conhe√ßa o gene, busque artigos sobre ele, veja os genes que est√£o envolta, como ele √© regulado,… Depois salve a sequ√™ncia do gene e mais ou menos 200 bp envolta dele em um documento word. Encontre o start c√≥don, o stop c√≥don, promotor,… e decida a sua estrat√©gia de clonagem.

Para desenhar primers para amplificar¬†o gene inteiro voc√™ precisar√° de regi√Ķes envolta do gene. Al√©m disso existem uma s√©rie de regras a que voc√™ precisa ficar atento para desenhar o primer como: composi√ß√£o de G-C, tamanho do primer, temperatura de anelamento, forma√ß√£o de d√≠meros e estruturas secund√°rias e muito mais. Para este trabalho, eu recomendo utilizar um software, o FastPCR. Um software livre (gratuito) e amig√°vel.

√Č preciso apenas colocar a sua sequ√™ncia de interesse e pedir para que ele desenhe os primers, depois voc√™ precisa checar se aquela sequ√™ncia amplifica a sua regi√£o de interesse.¬†Para a encontrar o primer reverso¬†na sua sequ√™ncia tem uma ferramenta para obter o reverso¬†complementar da sequ√™ncia, j√° que as sequencias de primers s√£o dadas no sentido 5¬ī – 3¬ī.

Finalmente, voc√™ pode fazer um PCR in silico, para isso, volte¬†para o Genbank e copie¬†toda a sequ√™ncia do genoma¬†da bact√©ria desejada (isso pode¬†demorar alguns minutos) e¬†passe para o FastPCR para fazer o PCR in silico com os primers desenhados. Com isso, voc√™ pode verificar poss√≠veis regi√Ķes amplificadas pelo seu par de¬†primers.

Depois de mandar sintetizar os primers, voc√™ pode fazer um programa como¬†mostrado no post anterior. Para a rea√ß√£o PCR voc√™ deve seguir o protocolo da sua Taq polimerase comprada. Vale a pena ressaltar que para amplifica√ß√Ķes de genes que ser√£o expressos posteriormente, recomendo uma Taq polimerase de alta fidelidade.

No pr√≥ximo post vou comentar sobre erros e solu√ß√Ķes comuns que ocorrem com rea√ß√Ķes de PCR.