FAQ #8 Como ver se a transformação gênica deu certo?

FAQ da Bioengenharia 8

Já colocamos nossos plasmídeos nos bichinhos, mas ainda não acabou. Essa é a hora de saber se tudo que fizemos até aqui deu certo!

Primeiro, colocamos eles na placa de seleção com antibiótico e só aqueles que realmente incorporaram o plasmídeo vão sobreviver porque ganharam um gene amigo de resistência ao antibiótico. Agora pegamos uma parte das células sobreviventes e fazemos um teste usando a PCR (você lembra dessa técnica, né?).
Como testar com a PCR?! Roubamos os plasmídeos dessas células e tentamos multiplicar o pedaço de DNA que foi grudado nele adicionando primers, nucleotídeos e enzimas sob aquecimento e desaquecimento. Se o nosso plasmídeo modificado tiver sido incorporado pelos micro-organismos haverá a multiplicação do pedacinho e podemos vê-los em uma eletroforese. Caso contrário, nada foi copiado e nada vai aparecer na eletroforese. Então temos o sinal de que alguma coisa não deu certo por aqui e as chances de erros deste teste são bem pequenas.

Depois vamos para um teste melhor ainda, o sequenciamento. Este teste diz exatamente qual √© a sequ√™ncia de pares de base da mol√©cula do plasm√≠deo e acabam de vez suas d√ļvidas se a transforma√ß√£o deu certo ou n√£o! O sequenciamento come√ßa parecendo um processo de duplica√ß√£o normal de DNA. Mas al√©m de cadeias molde, enzimas e nucleot√≠deos normais, h√° nucleot√≠deos especiais sintetizados (ddNTP’s) que possuem duas boas propriedades: emitem luz e interrompem o prologamento da cadeia a partir de onde foram adicionados. Ent√£o, imagine uma mol√©cula de DNA que possui um par de base A-T em um determinado comprimento e considere que a base A pertence √† cadeia molde e a base T √† cadeia complementar. Se esta base T for um nucleot√≠deo especial temos como identificar “quem √©” e “qual sua posi√ß√£o” na cadeia, pois ele emitir√° uma cor espec√≠fica para Timina e o comprimento de sua cadeia est√° interrompido na posi√ß√£o exata (n¬ļ 2 em verde).¬†Sequenciamento de DNAPodemos detectar a cor emitida atrav√©s de um espectr√≥grafo e a posi√ß√£o pelo tamanho revelado na eletroforese em gel (o sequenciador √© basicamente a uni√£o dos dois). Ou detectar o tipo de nucleot√≠deo presente n√£o pela cor, mas colocando os filamentos “lavados” por cada tipo de nucleot√≠deo em po√ßos diferentes do gel e interpretando a sequ√™ncia a olho nu/manualmente.¬†Depois de identificado o nucleot√≠deo da cadeia complementar √© poss√≠vel saber quem ocupa a mesma posi√ß√£o na cadeia molde, no caso citado √© a base Adenina.¬†Expanda esse racioc√≠nio para todas as outras bases da mol√©cula, com uma amostra grande teremos cadeias de todos os comprimentos poss√≠veis, interrompidas por um dos 4 tipos de nucleot√≠deos especiais (A, T, C, G), e assim √© poss√≠vel sequenciar toda a mol√©cula de DNA!

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Para saber mais sobre sequenciamento genético, clique aqui.

Por Otto Heringer e Viviane Siratuti.

 

FAQ #4 Onde colocar esses pedaços de DNA?

FAQ da Bioengenharia 4

‚ÄúNo genoma, n√©, d√™r!‚ÄĚ. Certo, mas como? E ser√° que o genoma √© o √ļnico lugar que podemos colocar esse novo pedacinho de DNA no micro-organismo que queremos modificar? N√£o! Existe outro lugar tamb√©m e ele se chama plasm√≠deo (quem j√° jogou BioShock vai soltar umas sinapses a mais agora).

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O plasm√≠deo √© um DNA circular presente em v√°rias esp√©cies de seres vivos e √© respons√°vel por conter informa√ß√Ķes valiosas envolvendo a sobreviv√™ncia do organismo a fatores externos (como por exemplo sua resist√™ncia a um antibi√≥tico), al√©m de ser o principal ator da transfer√™ncia horizontal de informa√ß√£o gen√©tica, ou seja, a passagem de um DNA funcional de um ser vivo para outro sem haver hereditariedade (√© a√≠ que o jogo BioShock extrapola isso para seres humanos).¬†Adivinha de onde veio a ideia de usar o plasm√≠deo como transmissor – “vetor” – de informa√ß√£o gen√©tica para modificar as c√©lulas? Veio exatamente desse mecanismo natural de realizar transfer√™ncia horizontal de genes que v√°rios micro-organismos possuem, ent√£o aproveitamos para fazer a transfer√™ncia das informa√ß√Ķes gen√©ticas que n√≥s queremos!

E se vamos usar plasm√≠deos √© preciso extra√≠-los tamb√©m!¬†Os plasm√≠deos s√£o mol√©culas de DNA assim como os pedacinhos obtidos a partir de um genoma, e multiplicados pela PCR, que vamos introduzir no microorganismo, mas aqui h√° uma etapa importante durante a¬†extra√ß√£o de DNA¬†onde √© feita a separa√ß√£o do conte√ļdo plasmidial do gen√īmico.

O vídeozinho abaixo tem uma animação no ínicio e depois mostra o procedimento do isolamento do plasmídeo em lab!

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Por Otto Heringer e Viviane Siratuti.

Cientistas descobrem novas ferramentas para reescrever o código da vida

O poder de editar genes √©¬†revolucion√°rio, √ļtil e com potenciais ilimitados. Por√©m,¬†a maior parte das ferramentas de edi√ß√£o de DNA s√£o lentas, caras e dif√≠ceis de usar ‚Äď √© uma brilhante tecnologia na sua inf√Ęncia. Agora, pesquisadores de Harvard desenvolveram uma t√©cnica que pode editar genomas de uma forma r√°pida e f√°cil, reescrevendo o genoma de c√©lulas vivas. A t√©cnica funciona como um processador de textos, que tem as fun√ß√Ķes de localizar e substituir. Ele reconhece uma seq√ľ√™ncia espec√≠fica no DNA e a substitui por outra.

‚ÄúPela primeira vez, estamos demonstrando que √© poss√≠vel fazer mudan√ßas gen√īmicas no n√≠vel do c√≥don‚ÄĚ, disse Farren Isaacs, um bioengenheiro da Universidade de Yale em New Haven, Connecticut. ‚ÄúN√≥s seremos capazes de introduzir novas funcionalidades em organismos”.

A t√©cnica, publicada na revista Science, explora a redund√Ęncia do c√≥digo gen√©tico. Os amino√°cidos, que comp√Ķem as prote√≠nas, s√£o codificados por combina√ß√Ķes de tr√™s letras de DNA chamadas c√≥dons. M√ļltiplos c√≥dons √†s vezes codificam o mesmo amino√°cido, por isso se diz que o c√≥digo gen√©tico √© degenerado ou redundante.

Isaacs e seus colegas escolheram um códon de parada, TAG, que, junto com o TAA e TGA, sinalizam o fim de uma cadeia de aminoácidos e a liberação da proteína formada. Como esses três códons apresentam a mesma função, os pesquisadores decidiram apagar todos os TAGs do
genoma de uma Escherichia coli e substitu√≠-los por TAAs, utilizando uma plataforma chamada “multiplex automated genome engineering, ou MAGE”. Isso deixa o TAG livre para codificar um novo amino√°cido.

Foram sintetizadas 314 fitas de DNA id√™nticas ao genoma da E. coli exceto que todos os TAGs, nas 314 fitas ao todo, estavam substitu√≠dos por TAAs. Em outras palavras,¬†cada uma das 314 fitas n√£o tinha todos os TAGs substitu√≠dos por TAAs, mas as 314 fitas juntas sim! Eles ent√£o aplicaram corrente el√©trica para permitir a entrada do novo DNA nas c√©lulas. Muitas repeti√ß√Ķes desta t√©cnica¬†resultaram na¬†obten√ß√£o de 31 linhagens da bact√©ria¬†com 10 dos genes modificados e¬†uma com 4. A equipe bolou um esquema para canalizar todas as 314 muta√ß√Ķes para uma c√©lula. Os pesquisadores fizeram uso da habilidade que as bact√©rias t√™m de transferir genes para outras bact√©rias, a conjuga√ß√£o: as 32 linhagens foram pareadas, sendo que uma linhagem doou seus genes mutados para a outra. As 16 linhagens resultantes foram pareadas para formar 8, e novamente para formar 4, condensando as muta√ß√Ķes ao longo desse processo. O processo foi batizado ‚Äúconjugative assembly genome engineering (CAGE)‚ÄĚ.

Ansiosos para compartilhar sua tecnologia, eles publicaram seus resultados assim que o CAGE atingiu a rodada semifinal. Os resultados sugerem que as quatro linhagens finais são saudáveis, mesmo com a quantidade de mudanças a que as células foram submetidas.

Ap√≥s mais duas rodadas de CAGE, segundo Isaacs, uma √ļnica linhagem da bact√©ria conter√° todas as 314 muta√ß√Ķes e ser√° livre de TAG, que ficar√° dispon√≠vel para codificar um amino√°cido artificial. Isso desafia as pessoas a imaginarem o genoma como algo muito male√°vel e edit√°vel. Alguns laborat√≥rios j√° criaram esses amino√°cidos, assim como a maquinaria necess√°ria para incorpor√°-los em prote√≠nas. ‚ÄúO grande avan√ßo aqui √© que n√≥s teremos um hospedeiro que permitir√° a incorpora√ß√£o de amino√°cidos artificiais a taxas muito superiores‚ÄĚ, disse Isaacs.

Estes organismos engenheirados seriam geneticamente isolados de outros organismos. A nova informa√ß√£o gen√©tica n√£o seria capaz de contaminar organismos naturais¬†porque, fora do laborat√≥rio, os¬†amino√°cidos naturais no lugar dos artificiais criariam prote√≠nas n√£o funcionais. Al√©m disso, esses organismos seriam imunes a v√≠rus que se baseiam na tradu√ß√£o prot√©ica tradicional ‚Äď importante para manter linhagens saud√°veis e √ļteis industrialmente. A import√Ęncia da imunidade viral reside no fato de que ind√ļstrias nas quais s√£o cultivadas bact√©rias, como as farmac√™uticas e energ√©ticas, esses v√≠rus podem afetar at√© 20% das culturas. Um exemplo not√°vel acometeu a Genzyme, cujas perdas devido a contamina√ß√Ķes virais podem ter variado de milh√Ķes de d√≥lares a at√©¬†$1 bilh√£o.

“Essa t√©cnica √© mais barata que tentar elaborar genomas a partir do zero. Ao modificar genomas existentes, a maior parte do trabalho j√° est√° feita”, disse o co-autor George Church, um geneticista da Harvard Medical School em Boston, Massachusetts.

Cientistas do J. Craig Venter Institute (JCVI), que no ano passado ‚Äúcriaram‚ÄĚ a primeira bact√©ria controlada por um genoma sint√©tico, dizem que o m√©todo traz coisas importantes para esse campo de estudo, mas s√≥ funciona na pr√°tica se o genoma desejado √© similar a um organismo existente. ‚ÄúUltimamente, no JCVI n√≥s estamos tentando fazer c√©lulas a partir do zero, e apenas uma s√≠ntese gen√īmica de novo tornaria isso poss√≠vel‚ÄĚ, disse um porta-voz do Instituto via email.

As duas t√©cnicas provavelmente ser√£o usadas em conjunto, disse Isaacs. ‚ÄúN√£o surpreenderia se essas tecnologias se unissem e n√≥s come√ß√°ssemos a ver t√©cnicas h√≠bridas inclusive mais poderosas do que as que vemos hoje‚ÄĚ.

Referências:

Precise Manipulation of Chromosomes in Vivo Enables Genome-Wide Codon Replacement  Isaacs, et al. Science 15 July 2011: 333 (6040), 348-353. [DOI:10.1126/science.1205822]

http://www.eurekalert.org/pub_releases/2011-07/hms-etg071111.php

http://www.nature.com/news/2011/110714/full/news.2011.419.html

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