Problemas com PCR!

Ap√≥s desenhar o seu primer, ¬†montar a sua rea√ß√£o e programar o termociclador, voc√™ pode enfrentar problemas para otimizar as sua condi√ß√Ķes de PCR. Algumas simples a√ß√Ķes podem resultar em um produto de PCR espec√≠fico. Estas s√£o as quest√Ķes mais comuns aqui no laborat√≥rio:

1. Estou tendo (muitos) fragmentos inespecíficos maiores do que o esperado. O que fazer?

РDiminuir o tempo de anelamento da reação;

– Aumentar a temperatura de anelamento (aumento 2 graus a cada teste);

– Diminuir o tempo de extens√£o;

– Colocar menos primers;

– Checar e colocar menos DNA;

2. Estou obtendo fragmentos inespecíficos menores do que o esperado. O que fazer?

– Aumentar a temperatura de anelamento;

– Aumentar o tempo de anelamento;

– Aumentar a temperatura de extens√£o;

– Aumentar a temperatura de extens√£o para 74-78 oC;

– Colocar menos primers e/ou menos DNA.

3. A reação estava funcionando antes, mas agora eu não obtenho nenhum produto.

– Tenha certeza que todos os componentes est√£o na rea√ß√£o (tamp√£o, DNA, primers…);

РTeste um novo Master Mix ou uma nova solução de dNTP (são sensíveis a descongelamentos consecutivos);

– Utilize um estoque novo de primers;

– Diminua sua temperatura de anelamento 6-10 oC, se n√£o obtiver nenhum fragmento verifique todas os componentes.

Nos pr√≥ximos posts vou comentar sobre t√©cnicas de PCR: como RT-PCR, dele√ß√£o de genes…