Calculadora para sítios de ligação com ribossomos (RBS)

RBSUm objetivo central da biologia sint√©tica √© programar c√©lulas para desenvolver fun√ß√Ķes valiosas. √Ä medida que se constroem sistemas gen√©ticas maiores e mais complexos (como os de escala gen√īmica), ser√£o necess√°rios modelos e t√©cnicas para combinar as partes gen√©ticas de maneira eficiente para se atingir um comportamento espec√≠fico. Para isso, ser√£o necess√°rios modelos biof√≠sicos que descrevam a rela√ß√£o de uma sequ√™ncia de DNA que a sua fun√ß√£o. Um passo muito importante nesse sentido foi dado pelo Grupo do Prof. Howard Salis, pesquisador que eu tenho o prazer de trabalhar dentro do Synberc, com o desenvolvimento da calculadora de RBS (ribossomal binding site ou s√≠tio de liga√ß√£o com o ribossomo). Engenharia gen√©tica de microrganismos √© um processo tempo intensivo (por ex. o desenvolvimento de uma nova rota metab√≥lica para a produ√ß√£o de um produto qu√≠mico pode levar de 5 a 10 anos de P&D para chegar a etapa industrial) que normalmente requer m√ļltiplas rodadas de tentativas e erro utilizando muta√ß√Ķes aleat√≥rias. √Ä medida que se torna poss√≠vel construir sistemas g√™nicos cada vez mais complexo (incluindo genomas completos), m√©todos automatizados para montagem desses sistemas e para otimiza√ß√£o de vias metab√≥licas se tornam necess√°rios para diminuir custos e tempo de desenvolvimento. Al√©m disso, com o aumento da complexidade do sistema, a aplica√ß√£o de m√©todos de tentativa e erro para sua otimiza√ß√£o se torna cada mais dif√≠cil e ineficaz. Uma maneira de otimizar um sistema g√™nico √© atrav√©s da varia√ß√£o da sequencia de seus elementos regulat√≥rios para controlar os n√≠veis de express√£o de suas prote√≠nas codificadoras. Cada passo limitante na express√£o de um gene oferece a oportunidade para modular racionalmente os n√≠veis de express√£o proteica. Em bact√©rias, s√≠tios de liga√ß√£o do ribossomo e outras sequencias regulat√≥rias de RNA s√£o elementos de controle eficientes para o in√≠cio da tradu√ß√£o. Como consequ√™ncia, essas sequ√™ncias s√£o comumente modificadas para a otimiza√ß√£o de circuitos gen√©ticos. Vias metab√≥licas e express√£o de prote√≠nas recombinantes. Assita um video bem interessante no Youtube sobre tradu√ß√£o. N√£o √© mostrado no video (e n√£o consegui encontrar um melhor) o RBS √© uma sequencia do RNA que direciona o ribossomo para o start codon, ele complementar a regi√£o do rRNA 16S que √© parte da subunidade pequena 30S do ribossomo. Basicamente, quando mais complementar o RBS √© ao 16S rRNA, maior √© a afinidade e maior √© a taxa de tradu√ß√£o. Como foi descrito no video, a tradu√ß√£o em bact√©rias (procariotos) consiste em quatro fases: inicia√ß√£o, elongamento, termina√ß√£o e o turnover do ribossomo (na verdade, esta √ļltima fase n√£o foi mostrada no video). Na maioria dos casos, o in√≠cio da transcri√ß√£o √© o gargalo do processo inteiro. O taxa de inicia√ß√£o de transcri√ß√£o se d√° pela combina√ß√£o de diferentes efeitos moleculares: incluindo a hibrida√ß√£o do rRNA 16S com a sequencia do RBS, a liga√ß√£o do tRNA formilmetionina ao start codon, a dist√Ęncia entre o s√≠to de liga√ß√£o do rRNA 16S e o start c√≥don, e a presen√ßa de estruturas secund√°rias de RNA que podem obstruir o RBS ou o start codon. Para o otimiza√ß√£o de express√£o de genes, √© muito comum o desenvolvimento de bibliotecas de sequencias de RBS com o objetivo de otimiza√ß√£o de fun√ß√Ķes de sistemas g√™nicos. Por√©m, a constru√ß√£o e sele√ß√£o de bibliotecas de sequ√™ncias se torna impratic√°vel com o aumento de prote√≠nas no sistema. Por exemplo, para realizar muta√ß√Ķes rand√īmicas em 4 nucleot√≠deos para um RBS resulta em uma biblioteca de 256 sequencias. O tamanho da biblioteca aumenta combinatoriamente com o n√ļmero de prote√≠nas do sistema, ou seja, 16,7 milh√Ķes de sequ√™ncias para um sistema com 3 prote√≠nas e 2,8 x 1014 sequencias para um sistemas com 6 prote√≠nas). Dessa maneira, se torna necess√°rios processos mais racionais para avaliar sequencias de RBS. A calculadora de RBS utiliza um modelo estat√≠stico termodin√Ęmico para predizer a taxa de inicia√ß√£o de tradu√ß√£o de uma prote√≠na. Dado um RBS e a regi√£o codificadora da prote√≠na, o modelo √© capaz de calcular a mudan√ßa de energia livre durante a montagem do complexo ribossomal 30S no RNAm (őĒGTOT). Depois, o modelo estat√≠stico √© capaz de correlacionar a taxa de in√≠cio de transcri√ß√£o com o őĒGTOT. Dessa maneira, o modelo biof√≠sico preenche uma lacuna de desenho racional de RBS, criando uma rela√ß√£o quantitativa entre um sequencia de letras (As, Gs, Cs e Us) e um n√ļmero (taxa de inicia√ß√£o de tradu√ß√£o). A calculadora de RBS, portanto, combina um modelo biof√≠sico com otimiza√ß√£o estoc√°stica para identificar uma sequ√™ncia sint√©tica (n√£o natural) de RBS que ir√° proporcionar a taxa de in√≠cio de tradu√ß√£o desejada. √Č importante destacar que esta rela√ß√£o tamb√©m depende dos 35 nucleot√≠deos iniciais da regi√£o codificadora da prote√≠na e que o RBS sint√©tico precisa ser desenhada com esta sequencia inclu√≠da. A calculadora de RBS est√° dispon√≠vel do site do laborat√≥rio do Salis . E √© muito simples de utilizar, basta criar uma conta de usu√°rio, recortar e colar as sequ√™ncias, e definir uma ou mais taxas de inicia√ß√£o de transcri√ß√£o. RBS calculator

Outras ferramentas para controle de transcrição também estão disponíveis como a Small RNA Calculator.

Bons experimentos!

Salis, H., Mirsky, E., & Voigt, C. (2009). Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression Nature Biotechnology, 27 (10), 946-950 DOI: 10.1038/nbt.1568

Problemas com PCR!

Ap√≥s desenhar o seu primer, ¬†montar a sua rea√ß√£o e programar o termociclador, voc√™ pode enfrentar problemas para otimizar as sua condi√ß√Ķes de PCR. Algumas simples a√ß√Ķes podem resultar em um produto de PCR espec√≠fico. Estas s√£o as quest√Ķes mais comuns aqui no laborat√≥rio:

1. Estou tendo (muitos) fragmentos inespecíficos maiores do que o esperado. O que fazer?

РDiminuir o tempo de anelamento da reação;

– Aumentar a temperatura de anelamento (aumento 2 graus a cada teste);

– Diminuir o tempo de extens√£o;

– Colocar menos primers;

– Checar e colocar menos DNA;

2. Estou obtendo fragmentos inespecíficos menores do que o esperado. O que fazer?

– Aumentar a temperatura de anelamento;

– Aumentar o tempo de anelamento;

– Aumentar a temperatura de extens√£o;

– Aumentar a temperatura de extens√£o para 74-78 oC;

– Colocar menos primers e/ou menos DNA.

3. A reação estava funcionando antes, mas agora eu não obtenho nenhum produto.

– Tenha certeza que todos os componentes est√£o na rea√ß√£o (tamp√£o, DNA, primers…);

РTeste um novo Master Mix ou uma nova solução de dNTP (são sensíveis a descongelamentos consecutivos);

– Utilize um estoque novo de primers;

– Diminua sua temperatura de anelamento 6-10 oC, se n√£o obtiver nenhum fragmento verifique todas os componentes.

Nos pr√≥ximos posts vou comentar sobre t√©cnicas de PCR: como RT-PCR, dele√ß√£o de genes…