Impressora 3D pode imprimir tecidos biológicos
Hoje em dia já se usam as impressoras 3D para a produção de moldes (scaffolds) para o cultivo de células, as chamadas bio-printers. Porém, é claro, os cientistas querem ir um pouco mais adiante. Vejam a matéria da BBC no Congresso AAAS sobre impressão 3D utilizando partes biológicas como matéria-prima para reconstrução de tecidos, orelhas e outras partes do corpo.
Bancos de dados, GenBank, homólogos e ortólogos.
Este final de semana montei uma nova página do synbiobrasil, na qual reuni os principais bancos de dados (http://synbiobrasil.org/databases/) de informações biológicas úteis para pesquisas.
Vou dar um exemplo de como utilizar o GenBank, que é um banco de dados de sequências de DNA e de aminoácidos do Centro Nacional de Informação Biotecnológica dos EUA. Além de concentrar informações sobre o sequências genéticas de milhares de seres vivos, o NCBI fornece uma série de ferramentas para trabalhar com essas informações. Uma delas é o Blast (basic local aligment search tool) que permite encontrar similaridades entre sequências de DNA.
Vamos a um exercício:
1. Entre no site: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
2. Escolha a opção Nucleotide Blast: para realizarmos uma comparação entre uma sequência de nucleotídeos com o banco de dados do GenBank
3. Recorte e cole esta sequência de DNA (sequência de DNA humano):
1 ggcacgtgac ggtcgggccg cctccgcctc tctctttact gcggcgcggg gcaagatcat
61 ggaagggaag tggttgctgt gtatgttact ggtgcttgga actgctattg ttgaggctca
121 tgatggacat gatgatgatg tgattgatat tgaggatgac cttgacgatg tcattgaaga
181 ggtagaagac tcaaaaccag ataccactgc tcctccttca tctcccaagg ttacttacaa
241 agctccagtt ccaacagggg aagtatattt tgctgattct tttgacagag gaactctgtc
301 agggtggatt ttatccaaag ccaagaaaga cgataccgat gatgaaattg ccaaatatga
361 tggaaagtgg gaggtagagg aaatgaagga gtcaaagctt ccaggtgata aaggacttgt
421 gttgatgtct cgggccaagc atcatgccat ctctgctaaa ctgaacaagc ccttcctgtt
481 tgacaccaag cctctcattg ttcagtatga ggttaatttc caaaatggaa tagaatgtgg
541 tggtgcctat gtgaaactgc tttctaaaac accagaactc aacctggatc agttccatga
601 caagacccct tatacgatta tgtttggtcc agataaatgt ggagaggact ataaactgca
661 cttcatcttc cgacacaaaa accccaaaac gggtatctat gaagaaaaac atgctaagag
721 gccagatgca gatctgaaga cctattttac tgataagaaa acacatcttt acacactaat
781 cttgaatcca gataatagtt ttgaaatact ggttgaccaa tctgtggtga atagtggaaa
841 tctgctcaat gacatgactc ctcctgtaaa tccttcacgt gaaattgagg acccagaaga
901 ccggaagccc gaggattggg atgaaagacc aaaaatccca gatccagaag ctgtcaagcc
961 agatgactgg gatgaagatg cccctgctaa gattccagat gaagaggcca caaaacccga
4. Em database, escolha a opção “Nucleotide collection”
5. Clique em Blast no final da página e aguarde a atualização da página.
Pronto, você acaba de comparar uma sequência de DNA humano com o banco de dados do GenBank. Isto permite que você compare o gene humano com todos os genes do banco de dados. Você pode ver que existem versões do mesmo gene para ratos, camundongos, galinhas,…
Com esses resultados podemos discutir alguns conceitos interessantes:
O que é um gene homólogo?
O gene homólogo a outro quer dizer que eles possuem um ancestral em comum, refletido na sua sequência de DNA comum. Se comparar as sequências de DNA, você vai ver que existem regiões entre o humano e o rato que possuem regiões idênticas, que provavelmente se mantiveram conservadas do ancestral comum (ou convergiram para a mesma sequência ao longo do tempo).
O que é um gene ortólogo?
Um gene ortólogo de um outro significa que eles são de espécies diferentes, (1) que possuem um ancestral comum e (2) a proteína codificada por este código genético manteve suas propriedades e funções. Você pode verificar isto, ao pegar um gene homólogo humano e colocá-lo em uma levedura com o gene homólogo inativado. Se por acaso, o gene humano restabelcer o comportamento normal da levedura, você saberá que aquele gene manteve sua função e pode ser considerado um ortólogo àquele gene homólogo de levedura.
O que é uma enzima?
Uma enzima é proteína que atua como um catalisador químico, que aumenta a velocidade ou facilita uma reação química. Uma enzima chamada glicosidase, por exemplo, quebra ligações químicas encontradas em açúcares, uma protease quebra proteínas, uma quinase adiciona fosfatos (PO4) a uma proteína, …. Proteínas estão envolvidas no metabolismo, na sinalização celular, etc…
Bacana né? Existe um monte de informação disponível nesses sites que podem ser acessadas gratuitamente para qualquer tipo de pesquisa! Bom proveito.
Grupos de Pesquisas em Biologia Sintética
Uma lista de grupos de pesquisa que trabalham com Biologia Sintética. Vale a pena conferir e acompanhar o trabalho desse pessoal.
Synthetic Biology Labs
Harvard University – Silver Lab
Harvard University – Laboratory for Molecular Automata
CalTech – Center for Biological Circuit Design
CalTech – Frances Arnold Research Group
University of Michigan – Del Vecchio Lab
University of Michigan – Ninfa Laboratory
University of Minnesota – Riedel Lab
University of Minnesota – Kaznessis Group
Duke University – Laboratory of Biological Networks
Synthetic Biology Engineering Research Center
Lawrence Berkeley National Laboratory – Synthetic Biology Department
UCSF/UCB Center for Engineering Cellular Control Systems
Stanford University – The Kool Group
Stanford University – The Smolke Lab
Virginia Bioinformatics Institute – Peccoud Research Group
Boston University – Gardner Laboratory
Princeton University – Weiss Lab
University of New Mexico – Molecular Computing Group
The University of Texas at Austin – Andrew Ellington
Mount Sinai Hospital – The Pawson Lab
Dresden University of Technology – Schwille Lab
EMBL-Heidelberg – Luis Serrano Group
ETHZ – Synthetic Biology Workgroup
ETHZ – Bioprocess Laboratory – Sven Panke
University of Cambridge – Jim Ajioka
University of Cambridge – Jason Chin
The University of Edinburgh – Alistair Elfick
Imperial College London – Paul Freemont
University of Groningen – Centre for Synthetic Biology
Ecole Polytechnique – Alfonso Jaramillo
Università degli Studi di Roma Tre – Luisi Synthetic Biology Lab
System & Synthetic Biology Labs
UC Davis – Michael A. Savageau
Boston University – Applied Biodynamics Laboratory
UCSD – Systems Biodynamics Lab
The University of Texas – Center for Systems & Synthetic Biology
Waseda University – Laboratory for Molecular Cell Network
Keio University – Sakakibara Lab
Kyushu Institute of Technology – Kurata Lab
Spanish National Biotechnology Centre – Logic of Genomic Systems Lab
Universitat Pompeu Fabra – Complex Systems Lab – Ricard Solé
Imperial College London – Institute of Systems and Synthetic Biology
Do-it-yourself biologists (DIYbio) e a ciência cidadã
Neste momento, em algum lugar dos Estados Unidos, da Inglaterra ou até da Índia, algum biólogo sintético amador está realizando um experimento na sua cozinha ou garagem. Nos últimos dois anos, entusiastas da biologia molecular têm se juntado para montar organizações de biologia sintética amadora, como o DIYbio (do-it-yourself biology), em que os membros se reúnem em pubs e barbecues para discutir os últimos experimentos realizados nas suas próprias garagens. Há quase seis meses tenho participado das discussões desse grupo, que apresentam conteúdo refinado e objetivo sobre o desenvolvimento de microscópios de 10 dólares, espectrofotômetros, centrífugas de furadeiras ou liquidificadores, construções de diferentes kits com E. coli modificada, chegando até a sequenciadores de DNA caseiros.
Inspirados pelos grandes avanços realizados em garagens pelos fundadores de atuais gigantes da informática, os também chamados biohackers pretendem revolucionar a ciência através de experimentos e idéias não-convencionais aplicados a biologia sintética.
Este movimento também se caracteriza pela chamada ciência cidadã (minha tradução de citizen science), em que os cidadãos ativamente participam no papel de desenvolver a ciência e as novas tecnologias. Além disso, a ciência cidadã estimula o apoio da população à ciência, o desenvolvimento do pensamento científico nas pessoas, além de introduzir novas idéias de diferentes disciplinas ao assunto. Utilizando a Internet como plataforma, um simples projeto de ciências pode envolver dezenas, centenas e milhares de pessoas de diversas formações no mundo dispostas a criar algo novo e interessante.
Porém, junto com o crescimento da ciência cidadã, tem também aumentado a preocupação do governo americano e do FBI a respeito do que os biohackers estão fazendo. Por incrível que pareça, agentes do FBI têm comparecido a reuniões do DIYbio para entender o que as pessoas estão fazendo e qual a possibilidade de utilização das ferramentas para o bioterrorismo. A comunidade DIYbio teme que o foco constante em possíveis atividades terroristas desvie a atenção dos tópicos importantes relacionados com biossegurança: como o descarte de bactérias geneticamente modificadas, normatização/legalização de laboratórios caseiros e equipamentos de segurança mais acessíveis e baratos.
Muitas vezes o que tem acontecido é que não existe nenhum tipo de norma ou lei que fale a respeito de laboratórios caseiros para a utilização de bactérias geneticamente modificadas.
Eu acho incrível o que está acontecendo neste momento. Não só está ocorrendo uma explosão de conhecimento e técnicas no mundo científico, mas também a população está cada vez mais interessada em fazer parte dessas descobertas e fazer da ciência um exercício cotidiano.
Ledford, H. (2010). Garage biotech: Life hackers Nature, 467 (7316), 650-652 DOI: 10.1038/467650a
Editorial, Nature (2010). Garage biology Nature, 467 (7316), 634-634 DOI: 10.1038/467634a
Workshop on Synthetic Biology and Robotics
Estou divulgando o Workshop on Synthetic Biology and Robotics da FAPESP no próximo dia 24, uma oportunidade imperdível para discutir alguns aspectos da Synbio. O programa está disponível no site da FAPESP e a inscrição é gratuita.
Biologia sintética e a computação
Ontem tivemos nossa primeira reunião do Clube Científico de Biologia Sintética para discutir o artigo “Synthetic biology: new engineering rules for an emerging disciplines.” A imagem abaixo resume bastante a abordagem dos autores do Departamento de Engenharia Elétrica Princeton para conduzir a revisão sobre o assunto.
Os autores traçam um paralelo entre a biologia e os computadores, no qual, não apenas se procura explicar a biologia celular utilizando a computação como analogia, mas também, mostra que já foram desenvolvidos componentes biológicos que funcionam como componentes de computadores. São dados exemplos de várias construções biológicas sintéticas que funcionam como componentes elétricos, como inversores (inverters devices), flip-flops (toggle-swicthes), osciladores (oscilators), amplificadores de sinais (transcriptonal cascades modules) e desviadores de sinais (diverter scaffolds). Restando assim, poucos módulos para se construir um microcomputador celular sintético.
Os autores comentam como estes módulos sintéticos e a condição endógena celular influenciam o comportamento um do outro, sendo que qualquer flutuação nos processos da célula hospedeira podem influenciar o módulo e sua reposta (output). Dessa maneira, torna-se necessário combinar técnicas de estimação de parâmetros e técnicas de análises de fluxos metabólicos para entender o contexto celular e os impactos desses módulos na célula. Para explicar isto de uma maneira resumida, a conectividade dos módulos entre si e com a célula não é suficiente para definir a dinâmica de uma rede, é preciso também incluir parâmetros cinéticos e regulatórios (velocidade das reações, feedbacks, efeito de reguladores…) que podem variar sua atividade de acordo com as mudanças realizadas no sistema original. Estes cálculos, porém, são muitos complicados e demandam uma matématica muito avançada. O que demonstra, mais uma vez, a necessidade de equipes multidisciplinares para a formação de grupos de pesquisa em synbio.
O artigo mostra também que células sintéticas estão se tornando cada vez mais fáceis de construir. Não só pela nossa capacidade de manipular os componentes celular, mas pelo aumento da nossa capacidade de sintetizar DNA. Existem porém, desafios e limitações nos tipos de atividades complexas que uma célula independente consegue realizar de uma forma confiável. Assim, uma nova fronteira para a synbio é distribuir redes e módulos sintéticos entre múltiplas células, formando sistemas de comunicações célula-célula, visando aumentar a possibilidade de desenhos e superar a confiança limitada de células sintéticas individuais. Para isso, já estão se desenvolvendo módulos de quorum sensing (mecanismos de comunicação celular) sintéticos que possibilitam a coordenação do comportamento de comunidades microbianas. Verifica-se, portanto, que muitos avanços têm sido realizados para aumentar a complexidade da arquitetura das redes sintéticas.
Este artigo é particularmente interessante porque mostra a visão de engenheiros elétricos do que é a biologia sintética. É importante destacar que existem diferentes visões e abordagens de pesquisa a respeito do que é a biologia sintética e como ela pode ser aplicada, dependendo da especialidade e background do grupo de pesquisa.
Nas próximas reuniões pretendemos abordar tópicos mais específicos da biologia sintética, como a construção de um oscilador sintético, e mostrar diferentes visões da biologia sintética.
Até lá!
Andrianantoandro, E., Basu, S., Karig, D., & Weiss, R. (2006). Synthetic biology: new engineering rules for an emerging discipline Molecular Systems Biology, 2 DOI: 10.1038/msb4100073
Regeneração de colunas Miniprep Qiagen
Eu sempre achei um desperdício enorme jogar fora as colunas presentes nos kits comerciais. Até que no ano passado, baseado em um protocolo simples e barato de Siddappa NP, publicado em 2007 na revista Biotechniques começamos a regenerar as colunas de extração de plasmídeo Miniprep Qiagen. Basicamente, as colunas são tratadas com 1 M de HCl durante a noite, lavadas repetidamente com água e reequilibradas com tampão EB ou TE.
Os autores do artigo estavam preocupados com a contaminação de DNA antigo nas colunas regeneradas e utilizaram RT-PCR e ensaios de transfecção para demonstrar que existe zero de contaminação nas colunas reutilizadas. Eles também demonstraram que a exposição prolongada a 1M de HCl não afeta a capacidade de ligação de DNA. Talvez seja apenas o prazer de usar uma coluna reutilizada, mas eu tenho a impressão que as colunas regeneradas funcionam melhor que as novas. Li em algum lugar que este protocolo funciona muito também para os Midi e MaxiPrep também.
O kit da Miniprep Qiagen com 50 reações custa cerca de R$350,00, dessa maneira, cada extração de plasmídeo custa cerca de 7 reais (contando apenas o custo de kit, sem contar eppendorfs, centrífuga, luz,…). Já utilizamos colunas regeneradas 5 vezes e queremos chegar até 10 regenerações, assim, poderemos realizar 50o extrações plasmidiais a cerca de R$o,35. Muito mais justo. O problema, agora, será a quantidade de buffers que você vai precisar. Mas não se preocupe, no final do artigo você vai encontrar os protocolos de tampões que podem ser utilizados no lugar dos comerciais (que acho que ainda podem ser otimizados).
Se alguém tiver outros protocolos para fazer render a verba, por favor, me avise!
Protocolo de regeneração das colunas de extração de DNA plasmidial:
1. Colocar em uma solução a 1N HCl por um dia (1 L para 100 colunas). Importante deixar as colunas imersas na solução sem bolhas dentro da coluna (costumo sonicar por 5 min para retirar bolhas de ar);
2. Lavar repetidamente (4 – 5 vezes) as colunas com H2O destilada autoclavada.
3. Deixar secar a 37°C por 24h (acima desta temperatura as colunas estragam). Selar em plásticos e anotar no saco quantas vezes aquela coluna já foi utilizada. Manter em local seco.
4. Antes de utilizar, reequilibrar a coluna com 50 µL de TE a 42oC. Eu sempre faço a eluição do DNA a 42oC para aumentar o rendimento.
Soluções do kit Qiagen:
Buffer N3: 4.2 M Guanidina-HCl, 0.9 M potassium acetato, pH 4.8
PS: já tentei o tampão de acetato de potássio do Birnborim (lise alcalina) mas não funcionou muito bem.
Buffer P1: 50mM Tris HCl pH, 10mM EDTA, 100µg/ml de RNase
Buffer P2: 200mM NaOH, 1% de SDS
Buffer PE: 10mM Tris HCl pH 7,5, 80% etanol, 100 mM NaCl
PS: a concentração do sal me parece ser fundamental para uma boa eluição, eu tentei várias concentrações e com 100 mM obtive os melhores resultados.
Buffer EB (TE): 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0
Para mais detalhes, consulte o site do autor.
BioBricks: fabricação de pequenos fragmentos de DNA
Este protocolo é utilizado para a fabricação de BioBricks pequenos, como promotores ou sítios de ligação do ribossomo (RBS). Para isso, utiliza o anelamento e extensão dos primers para criar um pequeno fragmento de DNA (~ 100 bp) utilizando Taq polimerase de alta fidelidade. O fragmento de DNA pode ser imediatamente utilizado em uma reação de clonagem utilizando TOPO-TA. Caso se deseje realizar uma etapa de digestão do fragmento de DNA, uma etapa de purificação de produto de PCR é necessária.
Materiais:
– Dois primers que se sobrepõe por ~20 bp.
Primer 1: 5′ ———————————– 3′
Primer 2: 3′ ———————————– 5′
– Mix para PCR Taq alta fidelidade
Método
1. Diluir os dois oligos a uma concentração de 25 μM utilizando H2O. Para primers maiores que 50-60 bp podem ocorrer problemas como erros e deleções, por isso, pode valer a pena incluir uma etapa de purificação extra PAGE (Invitrogen).
2. Misturar os reagentes em um tubo estéril de 0.6 mL:
- 9 μL PCR supermix
- 0.5 μL primer 1
- 0.5 μL primer 2
3. A reação de anelamento e extensão dos primers ocorrem no termociclador segundo o seguinte protocolo:
- 94°C por 5 mins
- 94°C por 30 seconds
- 55°C por 30 seconds (ou qualquer outra temperatura de anelamento)
- 72°C por 30 seconds
- Repita os passos 2-4 por 2-3 ciclos
- 72°C por 5 mins
4. Utilize 1μL de produto de PCR fresco (feito no mesmo dia) numa reação de clonagem com TOPO TA cloning.
Para desenhar um BioBrick por esse método não se esqueça de colocar o prefixo e sufixo dos BioBricks nos primers. Pronto, já descrevemos os protocolos para desenhar e montar um circuito sintético com promotores, RBS e genes.
Boa sorte e qualquer dúvida, por favor, pergunte!
Referências
Stemmer WP, Crameri A, Ha KD, Brennan TM, and Heyneker HL. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene 1995 Oct 16; 164(1) 49-53. pmid:7590320. PubMed HubMed PubGet [Stemmer-Gene-1995].
http://openwetware.org/wiki/Knight:Annealing_and_primer_extension_with_Taq_polymerase
BioBricks: fabricação de uma parte padrão.
Até agora comentamos sobre a possibilidade de juntar diferentes componentes utilizando o padrão técnico de montagem dos BioBricks. Mas neste post vou comentar sobre a fabricação de uma parte padrão. No futuro, eu pretendo comentar sobre a síntese de DNA sintético, mas agora vou explicar como montar um BioBrick utilizando o método de PCR. O aparelho para realizar um PCR, o termociclador, está presente na maioria dos laboratórios de biologia molecular, e hoje se apresenta como uma ferramenta básica para este tipo de atividade. Existem centenas de livros e sites na Internet que podem te familiarizar com a técnica. Primeiramente, um BioBrick pode ser construído via PCR se existe algum molde de DNA do qual o BioBrick possa ser amplificado (por ex., um gene de alguma bactéria) ou se a parte é pequena o suficiente que possa ser criada através do alinhamento e extensão do primer (iniciador). Nos dois casos é necessário adicionar na extremidade 5′ dos primers as sequências referentes aos sítios das enzimas de restrição presentes nos BioBricks, os sufixos e prefixos (ver post anterior).
A construção de BioBricks contendo sequências codificadoras de proteínas requer um sufixo e um prefixo um pouco mais especializados por duas razões:
1. o prefixo é alterado para garantir o espaçamento entre o sítio de ligação do ribossomo e o códon ATG de início.
2. BioBricks que codificam proteínas possuem, por padronização, dois códons de sequência TAA de parada.
Ao construir os primers, basicamente, é necessário “copiar e colar” a seguinte sequência de 31 bp no fim 5′ no seu primer upstream (ou iniciador universal) desenhado para o seu fragmento de DNA de interesse:
5′ —> 3′
GTT TCT TCG AAT TCG CGG CCG CTT CTA G ATG…
start codon (no caso de um gene)
E “copiar e colar” os seguintes 35 bp no fim 5′ do seu primer downstream (iniciador reverso):
5′ —> 3′
GTT TCT TCC TGC AGC GGC CGC TAC TAG TA TTA TAA….
duplo stop codon!
A estas sequências deve-se somar aproximadamente 20 bp de sequência de primer relativa a região codificadora. Para este tipo de clonagem se utiliza uma Taq polimerase com alta fidelidade e um kit de clonagem TOPO-TA cloning.
Claro que todas as outras precauções para se desenhar um primer ainda são válidas, como a verificação de sítios de restrição nas sequências. Para mais detalhes, veja o protocolo disponibilizado para a fabricação de BioBricks.