Microalgas na Biologia Sintética
Na penúltima reunião do Clube de Biologia Sintética foi discutido em que pé andam as pesquisas envolvendo microalgas – uma das milagrosas fontes energia sustentável e fixação de CO2 – no contexto da Biologia Sintética. O apresentador da vez, João Molino, com base nos conhecimentos que vem adquirindo no seu doutorado na Farmácia (FCF) aqui na USP, nos deu um review dos trabalhos com microalgas usadas em Biologia Sintética, além de falar um pouco de como as microalgas são incríveis para converter energia solar em bioprodutos e – consequentemente – fixar CO2. Com isso ele sugere no final algumas oportunidades que poderíamos usar para projetos do iGEM do ano que vem.
Vídeo com “Pipotecnica”
Como tivemos problemas envolvendo a transmissão da reunião (que já era feita de maneira precária), resolvemos gravar novamente a apresentação, só que desta vez utilizando uma nova pirotecnia dos vídeos da internet, o Popcornmaker (veja mais sobre ele nessa palestra de 4min no TED). Junto ao vídeo irão aparecer muitos links e informações extras diretamente da wikipédia em inglês (nunca substimem a wikipédia em inglês!), portanto se quiser saber mais sobre alguma informação “ao vivo” durante o vídeo, cheque os links! [clique na imagem abaixo para ir ao vídeo em outra aba]
Anotações Pessoais
Apesar do custo/benefício das pesquisas de microalgas na indústria não ser muito bom – segundo o que o Mateus me contou outro dia – suas características são muito provocativas para serem usadas como solução ecológica para muitos problemas e melhorar bastante processos de produção de bioprodutos já existentes. Ela faz coisas simplesmente incríveis. Como o João mostra no vídeo, ela é campeã na produção de galões/acre de óleo, além de poder viver em ambientes completamente isolados, como em uma garrafa fechada por exemplo – diga aí, qual ser vivo que você encontra no seu dia a dia (sem contar microalgas né…) que consegue viver muito bem e por muito tempo num ambiente completamente fechado e sem ar! Ela também fixa CO2 que é uma beleza, produz hidrogênio (hidrogênio cara!) e ainda pode ser usada como biorremediador (e de fato é naturalmente) para limpar áreas contaminadas!
Além de ser muito interessante biotecnologicamente, as microalgas são um grande gargalo na biologia sintética devido à falta de BioBricks e de elementos de DNA padronizados, como suas sequências terminadoras. O que é bem legal para o Registry of Parts e para o iGEM: partes inéditas! O time do chile do iGEM deste ano foi um dos primeiros a conseguir transformar cianobactérias (“parentes” das microalgas) com sucesso utilizando BioBricks na competição, o que é um bom indício para se trabalhar com microalgas.
O Grande Desafio
Apesar disso tudo, trabalhar com microalgas é algo bem desafiador, muito por causa do item mais valioso que se tem em laboratório: tempo. Um processo inserção de vetor nas células que duraria apenas (no máximo!) 2 dias de trabalhando com E.coli, com nossas amigas verdinhas duraria cerca de uma a duas semanas (se não me engano, segundo o que o João me contou). Para se fazer um projeto desse tipo estaríamos um pouco limitados para o pouco tempo do iGEM, a não ser que nos organizássemos muito bem (ainda estamos trabalhando nesse quesito). Mas o interessante é que aparentemente elas são bem geneticamente estáveis quando se tratando do vetor inserido; pelo o que o João nos contou, algumas microalgas transformadas duram anos com o seu novo pedaço de DNA. O processo de transformação também é aparentemente tranquilo e sem muito mistério.
Seguindo com os nossos objetivos de criar um projeto para o iGEM, muitas ideias surgiram da potencialidade de trabalhar com microalgas. Particularmente, comecei a pensar num sistema em que as microalgas “alimentassem” uns extremófilos, para que eles produzissem um efeito desejado com suas habilidades únicas da natureza – habilidades extremas! Mas discorro sobre isso em futuros posts.
Referência Principal
Durante o vídeo, muitas referências interessantes apareceram com ajuda do Popcornmaker, mas a referência principal que guiou o overview que o João nos fez é essa aí embaixo:
- Wang B, Wang J, Zhang W, & Meldrum DR (2012). Application of synthetic biology in cyanobacteria and algae. Frontiers in microbiology, 3 PMID: 23049529
Bactéria Sintética Segundo Craig Venter
Autor: Mira Melke
O Anúncio da criação da bactéria sintética pelo J. Carig Venter Institute (JCVI) foi há pouco mais de dois anos, em 2010. Na época, cientistas de várias regiões do mundo e de áreas distintas se pronunciaram a respeito do que o Próprio Venter chamou de “A Criação de uma nova vida”. Afirmação extremamente questionável, mas que movimentou a mídia como poucos cientístas conseguiram fazer até hoje. Essa afirmação foi tema do meu trabalho para a disciplina de Filosofia da Biologia e resolvi compartilhá-lo com vocês.
A base do meu trabalho foram dois artigos. O Primeiro deles é o publicado pela Science e pelo grupo do JCVI, intitulado “Creation of a Bacterial Cell Controled by a Chemically Synthesized Genome”. Reporta o design síntese e organização de um genoma completo de uma bactéria. Esse genoma foi posteriormente transplantado em uma bactéria que teve seu material genético extraído por completo.
O segundo, publicado pela Nature, apenas 7 dias depois, intitulado “Life After the Synthetic Cell” traz a opinião de oito especialistas na área da Biologia Sintética sobre as implicações para a ciência e para a Sociedade da “Célula Sintética” feita pelo JCVI.
Ambos os artigos podem ser encontrados facilmente no pubmed.
Antes de entrarmos propriamente na discussão filosófica, quero apresentar brevemente a proposta do trabalho e a metodologia utilizada. Na apresentação, está resumida em apenas um slide, mas quero detalhar um pouco de cada etapa.
Minimização do Material Genético
Essa etapa consistiu em determinar, a partir de dois organismos simples (duas cepas (linkar uma referência explicando a palavra cepa) de Mycoplasma mycoides) com o genoma conhecido. Muitos anos foram necessários para estabelecer o conjunto de genes que era estritamente necessários para a sobrevivência da bactéria. 100 de 485 genes testados foram considerados dispensáveis quando inibidos um de cada vez.
Design do Genoma
A combinação do resultado da minimização com algumas sequências de controle (watermarks) formou o genoma base para a síntese. Ele precisava conter apenas os genes essenciais para a sobrevivência da bactéria, ainda que o papel desses, individualmente, não tivesse sido elucidado.
O design da sequência foi realizado digitalmente.
Síntese em Quatro etapas
Essa síntese foi, de fato, o grande feito realizado pelo grupo. Eles “montaram” a partir de partes sintéticas bem pequenas um genoma com 1.08 mega pares de bases. No primeiro estágio, 10 cassetes de 1080 pb sintetizados (overlapping synthetic oligonucleotides) foram combinados, formando 109 assemblies de aproximadamente 10kb – setas em azul. Esses, em grupos de 10, foram recombinados para produzir os assemblies com aproximadamente 100 kb – setas em verde. Na etapa final, 11 desses foram combinados para produzir o genoma completo – circulo vermelho. Essas etapas foram realizadas, primeiramente em E.coli, as etapas finais, foram realizadas utilizando leveduras.
Para um melhor entendimento dos processos, recomendo que vá direto ao paper. Algumas leituras auxiliares podem ser necessárias.
Transferência do Genoma
O genoma sintetizado e montado foi transplantado em uma bactéria recipiente (Mycoplasma capricolum) que teve seu material genético totalmente removido. Toda a maquinália celular ( enzimas, organelas,membranas) estava intacta. Dessa forma, os elementos que seriam controlados pelo novo genoma e que atuariam sobre ele estavam presentes. Observe também que o gênero das bactérias (a que serviu como base para o genoma e a que recebeu o material genético sintetizado) é o mesmo. Sendo assim, é esperável que não haja rejeição ao novo material genético e morte da célula.
Após todos esses processos e análise do sucesso do transplante a “nova” bactéria foi capaz de auto-replicação e apresentou o crescimento logarítmico característico das bactérias. Algumas mutações ocorreram durante o processo, mas essas não alteraram o desempenho da célula. Dessa forma, foram mantidas.
Depois de milhares de replicações celulares, as características da célula, bem como todos os seus componentes celulares eram derivados do novo genoma sintetizado, não guardando nenhuma informação da célula recipiente. Com isso em mente, os cientistas do JCVI afirmaram que de fato, criaram uma célula sintética.
Tal afirmação foi extensamente questionada por boa parte da comunidade científica. Para não alongarmos muito a discussão, aconselho que sigam pela apresentação, e observem as opiniões e divergências sobre o assunto.
Minha opinião também se encontra a apresentação e estou disponível para continuarmos essa conversa pelo comentários, caso se sintam a vontade. Em caso de dúvidas, comente.
Apresentação disponível em: http://prezi.com/veskghxybqgv/nature-entra-na-discussao/
Um Abraço.
Modelagem em biologia (sintética), um guia para ateus em modelagem.
Para uma pessoa que lida diariamente com biologia, pode ser bastante difícil imaginar uma maneira de abordar matematicamente um problema em sua área ou como isto poderia ter alguma utilidade. A biologia é uma ciência considerada bastante complexa, pois são muitas as variáveis que podem afetar o sistema. Até mesmo um sistema relativamente simples como a expressão de uma proteína em E. coli, pode se tornar um problema bastante complexo de se modelar se todas as variáveis que afetam a expressão desta proteína forem levadas em consideração. Na realidade, não há nem mesmo quem seja capaz de listar todas estas variáveis. Assim sendo, como é possível fazer um modelo disto, se não consigo nem mesmo listar as variáveis que alteram meu sistema? Neste caso, melhor mesmo fazer como o Calvin e ser um ateu em modelagem, não é mesmo?
Na verdade não, fazer um modelo não é tão complicado assim. Pensar que é necessário colocar tudo no modelo é o erro conceitual mais comum de quem tem formação em áreas complexas como a biologia. Já os físicos por exemplo, tem uma visão dita reducionista, de tentar entender um problema dividindo-o em pequenas partes fundamentais e começar pelo modelo mais simples possível para depois aumentar a complexidade, se necessário (ou possível). Reza a lenda que um dono galinheiro certa vez chamou um fisico para solucionar o porquê as galinhas não estavam botando. Uma semana depois o fisico apareceu com a solução. Entretanto, a solução só era válida para galinhas esfericamente simétricas e no vácuo. True story!
Pode parecer contraditório, mas um modelo que leva mais variáveis em consideração não necessariamente é melhor ou mais “realistico”. Na verdade se um modelo leva mais variáveis em consideração do que outro e ambos tem a mesma efeciência, o segundo modelo é considerado melhor, conforme veremos.
Portanto, o melhor caminho para fazer um bom modelo é considerar as poucas e relevantes variáveis do problema, ou seja, ao fazer um modelo, a principal regra é:
Keep it simple, stupid!!
Este é o famoso princípio KISS, uma boa regra para começar um modelo. A maioria dos modelos funcionam melhor e são melhor entendidos se mantidos simples. Complexidade desnecessária deve ser evitada, mas obviamente, simplicidade demasiada não deve resultar em um modelo útil (como no caso das galinhas). Assim, uma boa maneira de se começar um modelo é pensar quais são as variáveis que devem ser realmente importantes para o problema. Tente formular seu modelo com o mínimo de variáveis e veja se seus resultados condizem com o esperado, ou com os experimentos. Se isto não ocorrer, é um sinal de que seu modelo ou é demasiadamente simples e você esqueceu alguma variável muito importante ou você pode ter feito hipóteses que não sejam válidas. Fazer hipóteses condizentes não é uma tarefa na simples e exige um conhecimento profundo do problema em questão.
O principio KISS é um conceito bastante semelhante à famosa navalha de Occam. Este princípio, introduzido por William Occam diz:
“Se em tudo o mais forem idênticas as várias explicações de um fenômeno, a mais simples é a melhor.”
Exemplo
Para exemplificar o que foi dito, vamos brincar de modelar com um simples exemplo que discutimos certa vez em nosso grupo.
O problema consiste em estimar a concentração de uma proteína (nosso caso era a Cre recombinase) dentro das bactérias E.coli, ou seja, quantas Cre-recombinases existem, em média, por bactéria? Esta inferência é base para estimar o PoPS (veja post anterior)
Este parece ser um problema simples mas pode se tornar bastante complicado de resolver caso o princípio KISS não seja utilizado. Quem é importante neste problema? Devo considerar a temperatura? Devo considerar a quantidade de alimento no meio?
Você pode pensar, e com razão, que a temperatura e a quantidade de alimento são importantes pois afetam a taxa de produção das proteínas. Entretanto estes são exemplos de variáveis que não precisam
ser levados em consideração pois, nos experimentos não trabalharemos com situações extremas de escassez de alimento nem de mudanças de temperatura e pequenas variações destas variáveis (fora de um regime extremo) não devem afetar significantemente a produção da proteína. Muitas são as variáveis que não afetam significamente o sistema e ter intuição disto é fundamental e repito, exige um bom entendimento do problema.
OK, mas por onde começar?
Bom, sabemos que para se produzir uma proteína primeiramente precisamos da produção do RNA mensageiro. A quantidade de mRNA certamente é uma variável relevante!!!
Portanto, vamos tentar criar uma equação sobre como o mRNA deve variar no tempo. A variação temporal de uma variável é representada matematicamente pela derivada da variável no tempo
Sabemos que nosso mRNA deve ser produzido pela leitura do DNA, feita pela DNA polimerase. OK, mas com que velocidade ela lê isto? Uma boa referencia, é o Bionumbers (tipo um google para dados biológicos)
Lá encontramos que nossa taxa de transcrição (Ktrans) é de, em média, 40 pares de base por segundo. Mas então precisamos saber qual o tamanho do RNA que gera nossa proteína. No caso da Cre é de 1032 pares de base (Nbp). Portanto, quantidade de proteína produzida por tempo e por volume (V) é de:
Dividimos pelo volume pois queremos saber a variação de concentração, ou seja, quantidade de proteínas por volume (unidade em Molar). Este será o primeiro termo de nossa equação, que se refere a produção do mRNA. Existem outras maneiras dele ser produzido? Se sim, novos termos devem ser adicionados. Neste caso, aparentemente esta é a unica forma dele ser produzido. Mas ele pode ser degradado, não é mesmo? Então precisamos de mais um termo, o de degradação. Novamente se formos até o bionumbers teremos a taxa de degradação (KdRNA) do mRNA. Este novo termo fará com que a taxa do mRNA diminua no tempo, e por este motivo ele é negativo. Portanto nossa equação fica:
Onde o termo positivo se refere a produção e o negativo se refere a degradação.
Agora vamos escrever uma equação para a tradução do mRNA em proteína. Neste caso encontramos uma taxa de tradução de 15 aminoacidos por segundo. Como nossa proteina tem 1032 pares de base ela deve ter 1032/3=344 aminoacidos. Como, além de produzida, nossa proteína também pode ser degradada então temos uma equação bastante semelhate à anterior:
Podemos supor que inicialmente a concentração desta proteína é zero, isto não fará diferença nos cálculos mas suponhamos que não haja proteina inicialmente. Ao longo do tempo, a concentração
desta proteína irá crescer até alcançar o equilibrio entre produção e degradação. Neste equilibrio, a concentração das proteínas não mudam mais no tempo e portanto nossas equações são iguais a zero. Para entender o equilibrio, pense na equação logistica que descreve a curva de crescimento de uma população de bactérias. Inicialmente temos um crescimento exponencial, mas depois de um tempo a população satura, ou seja, estabiliza em uma determinada população. Este ponto de saturação é que chamamos de ponto de equilibrio, onde a quantidade de bactérias não muda mais no tempo. Neste ponto, a quantidade de bactérias que morrem é proporcional às que “nascem”. Matematicamente o ponto de equilibrio é um ponto onde a derivada no tempo é igual a zero, portanto:
ou seja:
e
Agora podemos isolar a concentração do mRNA na primeira equação e substituir na segunda. Com isto, chegamos a:
Qual o sentido deste valor? Bem você pode utilizar o volume da bactéria e calcular qual a concentração de uma única proteína dentro de uma bactéria e você chegará que isto é aproximadamente 1 nM. Portanto, nosso resultado nos diz que há aproximadamente 2.000 proteínas, em média, dentro da bactéria.
OK, isto quer dizer que se eu fizer um experimento eu vou encontrar exatamente 2000 proteínas dentro da bactéria?
Obviamente não, devemos ter em mente a limitação de nosso modelo. Aproximações foram feitas e há muitas variáveis que podem fazer com que este valor mude. Entretanto, podemos dizer com certa segurança que teriamos algo de 1.000 à 10.000 proteínas na bactéria. Pode parecer muito inexato e que nosso modelo não foi tão útil por não ser preciso. Mas devemos lembrar que inicialmente não tínhamos nenhuma ideia de quantas proteínas haviam. Se alguém chutasse que há somente 10 ou 100 proteínas em média poderiamos pensar que era uma estimativa boa. Com o modelo sabemos que esta estimativa não é boa, que devem haver bem mais proteínas que isto!
Além da quantidade de proteína, com este simples modelo poderiamos estimar o tempo que demora para que a quantidade de proteína sature, ou seja, atinja o ponto de equilibrio. Estas são estimativas que podem ser muito úteis na hora de definir um protocolo experimental e pode economizar uma razoável quantidade de tempo e reagentes durante os experimentos. Portanto, não é necessário de ser ateu em modelagem, mas, tampouco, é recomendado acreditar religiosamente no modelo!!
Clube de Biologia Sintética 2012
Começaremos novamente nesta quarta feira (15 de agosto) as reuniões do Clube de Biologia Sintética!
Não importa a área: se você se interessar por biotecnologia, pesquisa interdisciplinar, gosta de aprender coisas novas e de resolver desafios, está mais que convidado!
Você de Exatas
No Clube você pode descobrir um novo mundo para “programar”, modelar e resolver problemas utilizando conceitos de engenharia para se fazer o design de sistemas biológicos.
NOTA: Nesse ano colocamos um Físico em um laboratório de Biologia Molecular; foi mais ou menos assim:
[youtube_sc url=”http://www.youtube.com/watch?v=3drspKkfIyE”]
Você de Biológicas
Nas reuniões você pode descobrir que a Biologia pode ser muito mais exata do que você conhece, e a diferença é só de abordagem.
E qual o Objetivo de Tudo Isso!?
Usar criatividade, interdisciplinariedade e empreendedorismo para esboçar um projeto para a competição internacional de máquinas geneticamente modificadas de 2013! E se divertir no processo, é claro!
A ideia é gerar propostas para serem apresentadas nas reuniões à partir de brainstormmings e referências indicadas por qualquer participante do grupo. É uma oportunidade de se aprender a como se iniciar um projeto do zero, planejar experimentos, verificar viabilidades, procurar materiais, custos, buscar financiamento, organizar pessoas, tempo e recursos; ou seja: tudo o que você precisa para se dar bem em qualquer empreendimento.
Já temos um pequeno cronograma ainda com detalhes a definir, mas com temas já escolhidos. Depois disso quem fará as reuniões serão os próprios participantes, convidados a apresentar suas ideias, assuntos interessantes e relevantes de synbio e qualquer outra coisa que se encaixe na reunião.
Nosso projeto para o iGEM 2012 ainda não acabou, mas vamos trazer toda a experiência que estamos acumulando para melhorar ainda mais ano que vem!
Horário: Das 18:30 às 20:00 hrs
Local: Sala “Fava Netto”, do ICB II – USP.
Vamos transmitir a reunião por Livestream. Colocaremos o link no facebook, twitter e aqui no blog quando iniciarmos a transmissão. Fiquem ligados!
Polimerase Por Segundo
A Biologia é imprecisa por natureza, e vice versa. Isso é uma grande dificuldade ao se fazer design de sistemas biológicos sintéticos; aquilo que é muito bonito no papel às vezes nunca pode ser feito por motivos obscuros e por excesso de ruído dos sinais do sistema. Não dá pra prever. Na tentativa de deixar dispositivos sintéticos mais previsíveis, a Biologia Sintética tenta padronizar não somente partes biológicas, mas também os sinais que a compõem a dinâmica de seu sistema. Esses sinais são justamente a passagem de informação entre DNA e o fenótipo desejado, mas… como diabos deixar isso mais preciso e medir a velocidade dessa passagem de informação? Como medir “Polimerases Por Segundo”?
Padronização da Transmissão de Informação
Independente do que um aparelho elétrico faça, existem sinais “universais” que pertencem a todos eles: variações na diferença de potencial, na corrente, no campo elétrico e etc. A transmissão de informação entre os dispositivos eletrônicos que compõem esse aparelho são dadas justamente através desses sinais, fazendo todo o sistema elétrico funcionar. Em circuitos genéticos, sinais análogos à corrente elétrica são as taxas de transcrição e tradução, ou mais especificamente, a velocidade com que – respectivamente – uma polimerase e um ribossomo “leêm” seus nucleotídeos. O problema é que esses sinais (as taxas de transcrição e tradução) não são bons como transmissores de sinais. Entenda o porquê:
PoPS e RiPS: Qual é o sentido disso!?
Para que um transmissor de sinal seja bom, ele precisa facilitar com que dispositivos possam ser facilmente combinados em um sistema – além de ser algo “universal”, como foi dito anteriormente. Foi aí então que, usando experiências da engenharia, os biólogos sintéticos cunharam o termo “PoPS” (Polimerase Per Second – Polimerase Por Segundo) e “RiPS” (Ribossome Per Second – Ribossomo Por Segundo). Muitos pesquisadores acham que a criação desses novos termos é como “reinventar a roda”: qual seria a grande diferença entre isso e as clássicas taxas de transcrição e tradução? A diferença é a abrangência da nova medida. Quando se trata de um sítio operador, um RBS, um RNAm e o próprio gene sendo “lido”, não há diferença alguma em se medir uma taxa de transcrição e o “PoPS” ou uma taxa de tradução e o “RiPS”. Mas faz sentido se medir a taxa de transcrição de um sítio terminador por exemplo!? Esse elemento de DNA, que teoricamente não é transcrito (é ele quem justamente para a transcrição), ainda pode eventualmente ter um “leak” e permitir a passagem de uma polimerase. Usar a expressão “… a taxa de transcrição de um sítio terminador …” não faz sentido nenhum, mas acontece. Se usarmos PoPS, que por definição é o número de vezes que uma RNA polimerase passa por um ponto específico de uma molécula de DNA por unidade de tempo, ainda há sentido, pois nessa definição não importa qual a região do DNA a Polimerase passa. É esse tipo de generalidade que permite o fácil uso e novas combinações de dispositivos sintéticos.
Hierarquia de Abstração
Com a criação de sistemas fáceis de se integrar, os engenheiros biológicos podem se beneficiar de métodos largamente praticados em qualquer campo da engenharia, como a hierarquia de abstração. Com isso é mais simples se lidar com a complexidade de sistemas biológicos quando se omite informações desnecessárias. Desse modo (ver imagem abaixo), alguém trabalhando no nível de abstração das partes biológicas não precisa se preocupar com o design e síntese do DNA que usará, do mesmo modo, alguém trabalhando no nível sistêmico precisa pensar em apenas quais dispositivos incluir e como conectá-los para realizar uma função desejada, sem precisar se preocupar com os outros níveis de abstração.
Como medir PoPS?
A maioria dos sistemas criados e estudados hoje em dia em Biologia Sintética envolve controle transcricional da atividade genética, o que faz do PoPS a variável mais difundida na área, principalmente pelas pesquisas envolvendo lógica booleana em sistemas genéticos (portanto não é muito comum encontrar “RiPS” em artigos por aí).
Não existe um método direto para se medir PoPS, mas é possível chegar em seu valor indiretamente através de medições de fluorescência de genes reporter. É possível – se você puder encontrar os parâmetros na literatura ou medí-los – encontrar o PoPS de um dispositivo em cinco passos:
Cinco Passos Para o PoPS
1. Ligação de um Gene Repórter como Output
Antes de mais nada, será preciso de um fluorímetro (é claro) e demum espectofotômetro para medir densidade celular. Como exemplo, vamos observar a parte BBa_F2620:
Esse BioBrick tem como “entrada” a substância de quorum sensing 3-oxohexanoil-homoserina lactona e tem como “saída” PoPS. Em presença de 3OC6HSL, o gene que produz o fator de transcrição luxR promove a transcrição de genes após o Lux pR, na parte final do BioBrick BBa_F2620. Para mensurar o quão ativo o luxpR fica, liga-se outro BioBrick no final do dispositivo para mudar o output do sistema colocando-se o BBa_E0240 – a ORF (Open Reading Frame) do GFP (Green Fluorescent Protein):
Assim tem-se uma nova parte, o BioBrick BBa_T9002:
2. Medição da Fluorescência e Absorbância e Subtração do Background
Para medir a fluorescência do GFP e a absorbância da amostra de células, é preciso criar dois controles: um da absorbância (A) e outro da fluorescência (G). O controle da fluorescência será o próprio BBa_T9002 sem ser induzido pela substância de quorum sensing (G_não-induzido), enquanto o controle da absorbância é feita da maneira trivial, verificando somente a absorbância do meio de cultura (A_background). Para se obter os reais valores de Fluorescência induzida por 3OC6HSL e da densidade celular, basta então subtrair esses valores de background com os valores medidos durante a indução pela substância de quorum sensing:
3. Correlação com a Curva Padrão
Com as correções em mãos, outro procedimento trivial a ser feito é encontrar a curva padrão de fluorescência versus GFP e de absorbância versus número de células. Por exemplo, experimentos feitos em laboratório chegaram a essas retas de correlação de valores:
Em que UFC é “Unidade Formadora de Colônia” – o número de células na amostra. E “GFP” seria o número de moléculas de GFP medidas.
4. Interpolar a Curva de GFP versus Tempo Obtida na Medição
A síntese total de GFP por célula (S_célula) é dada pela taxa de produção de GFP total (S_total) dividida pelo número de células (UFC):
Para encontrar a derivada de [GFP] por tempo, basta plotar os dados de GFP obtidos por tempo e interpolar com uma função logística (provavelmente) para obter a equação que melhor descreve a variação de GFP no tempo.
5. Colocar os Valores Nessa Equação Aqui
Depois de determinada a função Scélula, basta colocá-la nessa fórmula e encontrar o PoPS:
Em que:
a = Taxa de maturação do GFP – 1/s
GammaM = Constante de degradação do RNA – 1/s
GammaI = Constante de degradação do GFP imaturo – 1/s
Rô = Constante de síntese proteica por RNAm (RiPS) – [Proteína]/[RNAm].s
PoPS = Polimerase por segundo – [mRNA]/[DNA].s
CUIDADO: Conteúdo Matemático – Prossiga com Cuidado (Ou não…)
Chega-se nessa expressão através de um pequeno sistema de equações diferenciais:
As equações expressam uma dinâmica simplificada de um sistema de transcrição e tradução de uma informação genética. Para chegar na expressão de PoPS, basta substituir a última equação na segunda e isolar M. Com a expressão resultante, basta substituir a variável M na primeira equação e sua derivada em dM/dt.
ATENÇÃO: Aqui acaba o conteúdo matemático. Está tudo bem agora.
E essa é a história de como você pode encontrar o PoPS – essa variável estranha! – no seu próprio laboratório (ou ao menos entender do que se trata). Assim como um circuito elétrico, que pode ser montado da melhor maneira possível e mesmo assim não funcionar por razões obscuras, sistemas biológicos têm muito mais esse problemático costume de não se comportar como esperado. Contudo essa abordagem mais generalista da atividade transcricional de uma célula é uma boa maneira de se tentar enfrentar o grande desafio de se deixar a biologia mais “engenheirável” e mais “precisa”. Não que essa seja a coisa mais fácil do mundo, mas ela nunca será se ninguém tentar. E estamos aos poucos conseguindo.
Referências:
- Bio FAB Group, Baker D, Church G, Collins J, Endy D, Jacobson J, Keasling J, Modrich P, Smolke C, & Weiss R (2006). Engineering life: building a fab for biology. Scientific American, 294 (6), 44-51 PMID: 16711359
- http://partsregistry.org/Part:BBa_F2620:Experience/Endy/Data_analysis
- http://openwetware.org/wiki/Endy:Measuring_PoPS_on_a_plate_reader
A Incrível Sociedade dos Microrganismos
É bem óbvio que um ser humano não existiria sozinho. Não só porque ele não poderia ser gerado, mas porque dificilmente conseguiria sobreviver. Já reparou na quantidade de pessoas que permitem (e permitiram) que você tivesse o dia de hoje como você tem? Cada parafuso, tecido, metal, tijolo e etc que permite você estudar, trabalhar, andar de automóvel, comer e ler esse texto foram pensados, feitos, montados, transportados e vendidos por alguém. Não é possível portanto tentar entender os humanos, bem como a maneira com que eles se comunicam, isoladamente. É preciso olhá-los sistemicamente, como seres sociais. As bactérias também. É cada vez mais reconhecido que as bactérias não existem como células solitárias, mas são como um “organismo colonizador” que elabora complexos sistemas de comunicação que facilitam a sua adaptação às recorrentes mudanças ambientais. E elas nascem poliglotas. A seleção natural esculpiu em diferentes espécies diversos genes que as permitem se comunicar cooperativamente e repressivamente entre espécies e até mesmo entre reinos (como por exemplo em bactérias patogênicas). Damos à essa comunicação bacteriana o nome de “quorum sensing” (“detecção em quórum” – tradução livre).
Quorum Sensing
O termo “quorum sensing” foi cunhado devido à habilidade dos microorganismos expressarem ou aumentarem a expressão de certos genes quando em grande população, podendo dessa forma monitorar a densidade celular (quantidade de células ao seu redor) antes de manifestar algum fenótipo. Um dos exemplos mais ilustrativos disso é da Dictyostelium discoideum, um protozoário que passa uma das fases do seu ciclo de vida produzindo um corpo multicelular. Tem um vídeo bem legal mostrando a formação de um corpo de frutificação através de várias células individuais de Dictyostelium:
[youtube_sc url=http://www.youtube.com/watch?v=vjRPla0BONA]
Reparem rapidamente em 00:30 min as células se locomovendo em “pulsos”, na direção de um local em que todas estão se agregando (é difícil de perceber!). Esse local inicial é em geral onde um grupo de bactérias encontrou alguma fonte de nutrientes. A “pulsação” da locomoção das bactérias acontece devido à substância de quorum sensing que é difundida pelo espaço vinda das células do local de agregação; um pulso inicial provoca – quando em uma população não muito grande, para ser perceptível – um comportamento oscilatório de resposta das células: quando uma célula recebe um sinal (do tipo “Ei, tem comida aqui!”), ela emite um de volta (como se etivesse gritando “Caramba, tem comida lá!”), que é recebido pelas células que mandaram o sinal incialmente (o que seria um “Ótimo! Estou indo praí!”) e por outras ao seu redor, propagando o sinal. Como a transmissão de informação com as substâncias não é imediata e nem totalmente contínua, observa-se os “pulsos”, que são resultado do “gap” entre enviar e receber informações pela difusão de moléculas.
As diferentes Línguas das bactérias
As “línguas”, ou simplesmente certas coisas que as bactérias querem “dizer” (como “Estou afim de dar uma reproduzida!” ou “Fujam, eles estão vindo!”) são “ditas” através de diferentes tipos de substâncias que os microorganismos produzem. No caso da Dictyostelium ali em cima, a substância é AMP cíclico (é quase um ATP, só que duas vezes menos fosfatado… e cíclico, é claro), mas se tratando de bactérias – que ainda é a principal plataforma de aplicação da Biologia Sintética – existem três tipos principais de substâncias de quorum sensing: as acil-homoserinas lactonas (HSL ou AHL), auto-indutores 2 (AI-2) e pequenos ácidos graxos, chamados de “DSF”s (Diffusible Signal Factor – do inglês: Fator Sinalizador Difusível). Existem ainda outras famílias de substâncias de QS, mas aparentemente menos comuns que essas três principais.
O Mecanismo Gênico
Para um microrganismo ganhar a abilidade de “falar em outra língua”, em geral são necessários apenas três elementos de DNA: um gene que gere uma enzima que produza uma substância de QS, outro gene que produza o “receptor” dessa substância – que em geral é um fator de transcrição – e um promotor, no qual o fator de transcrição (após se associar à substância de QS) se liga para controlar a expressão gênica (imagem ao lado).
Se uma bactéria (por exemplo) “fala” a mesma “língua” que suas companheiras de colônia, como ela diferenciaria então um sinal próprio (a própria substância de QS sendo produzida) de um sinal de outras células (substância de QS externa)!? Isso é importante, porque se a bactéria receber o próprio sinal que envia, ela entrará em um processo autocatalítico que resultará em uma contínua auto-ativação da célula independente do sinal das bactérias ao seu redor. Acontece que uma bactéria não produz níveis suficientes de QS para “se ouvir”. Sem o sinal externo, a transcrição de genes pelo sistema de quorum sensing é fraca e insuficiente para iniciar um feedback positivo; apenas em alta densidade celular se consegue alcançar uma concentração crítica de substâncias de QS para estimular a transcrição dos genes que o QS controla.
Quorum Sensing no iGEM
Apesar de não ser um meio de transmissão de informação tão rápido e eficiente como o dos light switches, os sistemas de QS são bastante utilizados em dispositivos sintéticos devido à sua especificidade e falta de “falsos sinais” – afinal, é extremamente fácil estimular não-intencionalmente uma célula sensível à luz. No Registry of Parts existem cerca de 6 sistemas de QS completos, padronizados e disponíveis para construção, todos usando (em geral) diferentes AHLs, usados tanto na ativação e inibição da expressão de genes.
Exemplos de utilização desse sistema de transmissão de informação não faltam no iGEM. Já tratamos no blog de um dos inúmeros projetos do iGEM que utilizam quorum sensing, o da Unicamp de 2009. Em seu projeto, o time brasileiro utilizou sinais de AI-2 como um “sistema de alerta” em bactérias produtoras de bioprodutos em um bioreator. Quando um microrganismo contanimante surgisse (produzindo AI-2), o sistema de QS atuaria para comunicar sua presença a todas as bactérias ao redor do organismo invasor, iniciando gatilhos gênicos para produção de substâncias nocivas ao contaminante, afim de exterminá-lo do bioreator.
Aprender como uma população de microrganismos de comunica é extremamente útil para saber como ela se comporta, e no caso da biologia sintética, muito útil para conseguir controlar esse comportamento para transmitir informações em um dispositivo gênico sintético. Mas é claro que prever todo um comportamento de um sistema biológico não é nada fácil. Como já salientava Asimov, há algo em comum no comportamento de humanos e átomos: ambos são muito previsíveis singularmente, mas praticamente caóticos quando em coletivo. Apesar de mais simples, populações de microrganismos também se comportam assim, o que é uma das razões que tornam o trabalho em laboratório muitas vezes frustante e cansativo. Um guia nesse caos é essa compreensão sistêmica da comunicação entre bactérias (que origina certas resistências a antibióticos inesperadas e outras coisas bizarras), que assim como seres humanos, as torna seres mais sociais do que você possa imaginar.
Referências
- Whitehead, N. (2001). Quorum-sensing in Gram-negative bacteria FEMS Microbiology Reviews, 25 (4), 365-404 DOI: 10.1016/S0168-6445(01)00059-6
- Atkinson, S., & Williams, P. (2009). Quorum sensing and social networking in the microbial world Journal of The Royal Society Interface, 6 (40), 959-978 DOI: 10.1098/rsif.2009.0203
- He YW, & Zhang LH (2008). Quorum sensing and virulence regulation in Xanthomonas campestris. FEMS microbiology reviews, 32 (5), 842-57 PMID: 18557946
Um por Todos e Todos por Um! Agradecimentos à Multidão que Faz Acontecer!
Acho que conseguimos fazer algo sensacional. E aparentemente inédito também. Eu já disse em outro post o quão somos todos poderosos com a internet, e foi com esse incrível poder – quase utópico – que conseguimos ser (pelo o que tudo indica) o primeiro projeto de ciência brasileiro a ser financiado com sucesso por crowdfunding, com incríveis 109% financiados.
Até agora não caiu a ficha que conseguimos quase cerca de 6000 reais em um mês e meio. Me lembro do dia em que cheguei no meu apartamento e disse aos meus colegas: “Cara, eu preciso de 2700 dólares nos próximos dois meses!” (antes de me explicar acharam que estava envolvido com algum tipo de máfia de agiotas).
Eu não fazia a mínima ideia de como arrumar esse dinheiro. Parecia impossível. Tínhamos caído em uma grande “sinuca financeira” ao tentar pedir financiamento pela universidade para um projeto que não se encaixa direito em quase nenhum dos programas de apoio que ela oferece. Essa é a sina da inovação: não existe nada pré-definido para aquilo que é novo. Bem, como estávamos fazendo algo novo, porque então não sair do óbvio? Porque esperar sempre apoio das mesmas fontes de financiamento que ditam o que pode e o que não pode ser feito? Foi aí que o Hotta me veio com a intrigante ideia: “Porque vocês não tentam financiamento por esse site aqui?”. Desde então descobri que além de algo chamado crowsourcing, existe algo tão velho quanto o imposto de renda (só que um pouco diferente) chamado crowdfunding, o financiamento pela multidão.
Sem saber a dificuldade de tal tarefa, simplesmente criei uma página de financiamento no RocketHub (o site de crowdfunding que usamos) para um projeto brasileiro de Biologia Sintética. De novo: brasileiro e em algo chamado Biologia Sintética. Como fazer a multidão se interessar por esse projeto dentre vários outros bem mais atrativos envolvendo música, filmes, arte e etc? Estereotipando, éramos um projetinho latinoamericano nerd junto de vários outros gringos, super chamativos e descolados. Eu não sabia em que estava me metendo. Talvez seja por isso que a ficha ainda não caiu depois que tudo deu certo. Você tabém não iria acreditar na quantidade de pessoas que existem aí fora dispostas a apoiar suas ideias.
Seguimos à risca as recomendações que o site dá para conseguir os projetos financiados: entrar em contato primeiro um círculo de pessoas diretamente relacionadas conosco e depois com um círculo de pessoas desconhecidas. O engraçado é que ficou tudo misturado. Ao mesmo tempo que apareciam pessoas totalmente não-relacionadas com qualquer pessoa do grupo, apareciam amigos e parentes dando uma engordada na vaquinha online.
Em cada email que recebia com uma quantia de dinheiro, independente da quantia que fosse, era como um pequeno presente de natal fora de época. Mais do que pessoas dando dinheiro a nós, tínhamos pessoas acreditando no nosso projeto, acreditando em nós. É aquele tipo de coisa que os cartões de crédito nos ensinaram muito bem que não tem preço. É principalmente por isso que por mais que eu escreva, não vou encontrar palavras para agradecer esse apoio de todos deram, seja de amigo, parente, professor, blogueiro, empresa, escritor, entusiasta e parceiro do grupo. Fomos muito além da expectativa mais otimista que tínhamos. Estamos muito mais motivados, felizes e com certeza de toda a responsabilidade que temos agora, que além de representar nosso país na maior competição de Biologia Sintética do mundo, é fazer todos os apoiadores também merecedores (além dos rewards, é claro) do sucesso que tivermos. Mas por enquanto gostaríamos muito de dizer:
Joana Guiro, Tania, Douglas Domingues, Cristiano Breuel, Kathleen Raven, Elias de A. Rodrigues, Renilda Souza, Roseane Souza, Adriana Marcelino Escarabichi, Regivaldo, Bruno Vellutini, Cleandho, Cristina Caldas, Luis Brudna, Daniel Ariano, Bernardo Lemos, Silvério Flora Filho, Alex Gorshkov, Shridhar Jayanthi, Carlos Gustavo, Marcus Nunes, Carlos Hotta, Gilberto, Andrés Ochoa, Blog Blabos de Blebe, Mateus Schriener G. Lopes, Mariana Machado de Paula Albuquerque, Jean Marcel Duvoisin Schmidt, Débora Pimentel, Andre Pimenta Freire, Rafael Calsaverini, Bruno de Medeiros, Integrated DNA Technologies (IDT), Felipe (phi!), Carolina Carrijo, Rafael Tuma Guariento, Fábio Cespedes, Carolina Menezes Silverio, Konrad Förstner, Francisco Camargo (Chico!), Cláudia Chow, Roberto Takata, e o Instituto de Pesquisas Sociais, Políticas e Econômicas…Há ainda muito trabalho pela frente e vários outros desafios a serem encarados, mas esse nosso primeiro sucesso tangível já está ganhando repercussão em alguns lugares, como no blog sobre ciência da revista piauí (“De grão em grão“) e no blog do próprio RocketHub (“Brazilian Science Dreams Comes Alive” e “A RocketHub Story: Dreamers Don’t Blink“). Espero que essa moda gringa pegue por aqui, e que ainda possamos ver no Brasil vários projetos científicos criativos mais livres, abertos e possíveis com crowdfunding, sem depender muito dos programas pré-formatados de apoio à pesquisa e desenvolvimento. Afinal, como já disse no nosso vídeo promocial: “Because when you help science, you help everyone!”.
OBS: agora eu tenho uma exclusiva “Wings Badge” no RocketHub! A melhor badge que já ganhei! 😀
Computadores bacterianos
De acordo com o verbete da wikipedia, um computador é uma máquina programável desenhada para, automaticamente, realizar um sequência de operações aritiméticas ou lógicas. Um computador pode prover-se de inúmeros atributos, dentre eles armazenamento de dados, processamento de dados, cálculo em grande escala, desenho industrial, tratamento de imagens gráficas, realidade virtual, entretenimento e cultura. Os primeiros computadores analógicos surgiram no século XVII e eram capazes de realizar as funções básicas de somar, subtrair, multiplicar e dividir. Mas foi na II Guerra Mundial, em meados do século XX, que realmente nasceram os computadores atuais. A Marinha dos Estados Unidos, em conjunto com a Universidade de Harvard, desenvolveu o computador Harvard Mark I, projetado pelo professor Howard Aiken, com base no calculador analítico de Babbage. O Mark I ocupava 167m2 e pesada cerca de 30 tonelada aproximadamente, conseguindo multiplicar dois números de dez dígitos em três segundos.Seu funcionamente era parecido com uma calculadora simples de hoje em dia. Nem é preciso falar o quanto esta tecnologia se desenolveu até hoje, em que hoje se discuti processadores quânticos e se faz computação em nuvem. Uma plataforma diferente das “baseadas no silício”, que estamos acostumados, são os biocomputadores. Em 1994, em um experimento muito elegante, Leonard Adleman desenvolveu o primeiro experimento envolvendo um computador de DNA para resolver o problema do Caminho Hamiltoniano: um problema que envolve caminhos hamiltonianos é o problema do caixeiro viajante, em que um caixeiro deseja visitar um conjunto de N cidades (vértices), passando por cada cidade exatamente uma vez, fazendo o caminho de menor tamanho possível (Figura 1).
Figura 1. O grafo em vermelho é hamiltoniano.
Cada bola é um nó e cada flecha é uma aresta. Existem multiplas possibilidades de construir um computador baseado em DNA, em que cada um possui suas vantagens e desvantagens. A maioria deles funciona utilizando as portas lógicas (AND, OR, NOT) associadas a lógica digital utilizando como base o DNA, como por exemplo, o contador bacteriano . Porém os primeiros computadores moleculares baseados em DNA, são reações in vitro utilizando, por exemplo, enzimas de restrição, ligases, e DNA (Benenson et al. 2001). Através da mistura desse componentes e reações em cascada de digestão, ligação e hibridização, o output final é uma molécula detectável que representa o resultado computacional. Em 1994, Leonard Aldleman foi capaz desenvolver um computador in vitro baseado em DNA para solucionar o problema do Caminho Hamiltoniano (Figura 1), porém apenas em 2009, Baumgardner e colaboradores conseguiram resolver um problema complexo in vivo, em E. coli. Porém, para entender, é necessário uma série de abstrações para tornar sequências de DNA em vértices e arestas de um caminho hamiltoniano (ver Figura 2). A primeira abstração trata segmentos de DNA como as arestas de um determinado grafo. As arestas de DNA são flanqueados por sítios hixC que podem ser embaralhados por um recombinase Hin, criando diversas ordens e orientações randômicas para as arestas do grafo. A segunda abstração está relacionada com os nós, com exceção do nó terminal, em que um nó é um gene divido ao meio por uma sequência hixC. Os autores conseguiram construir enzimas funcionais portando essas sequências codificadas no DNA. Dessa maneira, a primeira metade (5´) de um nó é encontrada na aresta de DNA que termina em um nó, enquanto a segunda metade (3´) do gene é encontrado em uma aresta de DNA que se origina no nó. Calma, realmente não é fácil entender, é preciso pensar e abstrair, veja a figura 2.
Figura 2. Construção de DNA que codificam um problema do Caminho Hamiltoniano com três nós. a. O grafo contendo o caminho Hamiltoniando começa no nó RFP, procedendo para o nó GFP e terminando no nó TT. b. Construção ABC representam a solução para o problema dos três nós. Os três fragmentos de DNA flanqueado por hixC estão na ordem e orientação corretas, de maneira que os genes GFP e RFP estão intactos. ACB possui o gene RFP intacto, porém o gene GFP está errado, por fim, a construção BAC não possue nenhum gene intacto.
A Figura 2a mostra o grafo com os 3 nós e as 3 arestas que foram escolhidas para serem codificados no computador bacteriano. O gráfico contêm um único caminho hamiltoniano que começa no nó RFP, viajando pela aresta A até o nó GFP, e utilizando a aresta B até alcançar o nó final TT. A aresta C, the RFP até TT é um detrator. A Figura 2b ilustra como as construções de DNA foram utilizadas para solucionar o problema do Caminho Hamiltoniano com um controle positivo e duas configurações sem soluções. Já que as soluções precisam originar no nó RFP e terminar no nó GFP, a aresta A de DNA contêm na extremidade 3´a metade de RFP seguida por a extremidade 5´de GFP. A aresta B de DNA se origina em GFP e termina em TT, dessa maneira, esse fragmento de DNA possui 3´GFP seguido de um terminado de transcrição duplo. A aresta C se origina em uma metade 3´ de RFP e termina em TT. Finalmente, com os genes codificadores para RFP e GFP estão intactos, com promotores e RBS, e seguintes de um terminador de transcripção, colônias ABC expressam fluorescência vermelha e verde, dessa maneira, possuem aparência amarela.
Para concluir a abstração eu gosto de imaginar que a recombinase Hin é o caxeiro viajante que faz o seu caminho pelo DNA e a sequência de DNA contem o mapa do caminho realixado.
A programação de bacteria para computar soluções de problemas complexos podem oferecer as mesmas vantagens dos computadores atuais que estamos acostumados, porém, com as seguintes características adicionais: (i) sistemas bacterianos são autônomos, eliminando a necessidade de intervenção humana, (ii) computadores bacterianos podem se adaptar a condições flutuantes, evoluindo para resolver desafios de determinados problemas e (iii) o crescimento exponencial de bactérias continuamente aumente o número de processadores trabalhando em um problema (Baumgardner et al., 2009). Sem contar que eles ainda poderiam fazer fotossíntese…
Adleman LM: Molecular computation of solutions to combinatorial problems. Science 1994, 266:1021-1024.
Benenson Y, Paz-Elizur T, Adar R, Keinan E, Livneh Z, Shapiro E: Programmable and autonomous computing machine made of biomolecules. Nature 2001, 414:430-434.
Baumgardner , J et al. Solving a Hamiltonian Path Problem with a bacterial computer. J. Biol. Eng. 2009, 24;3:11.