iGEM 2012 Latin America: Estivemos Lá!
É verdade que estivemos lá mesmo. Pode acreditar!
USP &Unesp iGEM 2012 team
Esse ano foi a primeira vez que houve um evento genuinamente da América Latina. A primeira divisão da competição em Jamborees regionais aconteceu no ano passado, durante a segunda participação brasileira pela Unicamp, mas as regionais para os latinos foram realizadas em Indianápoles, nos EUA.
Se você criar uma conta no Registry of parts, é possível ter acesso ao fórum onde foi discutida onde seria a sede do evento regional na América Latina em 2012. O Brasil até se ofereceu na época através das meninas do time da Unicamp de 2011, mas um time Panamenho e Colombiano já chegaram “com tudo”, apresentando propostas para tornar suas universidades sede do evento juntamente com uma análise do transporte e hotelaria da região.
Bogotá
Foi meio peculiar a sensação de explicar para as pessoas que encontrávamos na viagem que estávamos indo para a fase regional da “competição internacional de máquinas geneticamente modificadas”. Mas mais peculiar ainda foi a impressão de Bogotá: uma metrópole pouco vertical, com ônibus engraçados, extremamente militarizada e com supermercados com produtos bem americanos (coisas grandes). Ah! E tem mais uma coisa que fomos perceber só depois de algum tempo: como motoristas colombianos curtem uma buzina!
Em Bogotá quase todos os ônibus têm uma cara bem maluca.
Acreditem ou não, o sistema de ônibus de Bogotá é inspirado no de Curitiba. A grande diferença é que em Curitiba aparentemente o negócio funciona, em Bogotá não – fiquei com saudade dos ônibus e metrôs de São Paulo (menos da estação praça da Sé/Luz em horário de pico).
Fomos o único time a não ficar no hotel recomendado pelos organizadores. Esse hotel cuidaria do nosso transporte até à Universidade dos Andes, onde o evento aconteceu. Portanto, para eviar ágio dos taxistas por causa da nossa cara de turista, usamos o sistema de ônibus inspirado no análogo curitibano, o Transmilênio. Só conseguimos sobreviver por lá graças a nossa líder de logística e tradutora Macarena – a chilena mais brasileira do iGEM.
Inscrição
O evento foi sediado na Univerdidade dos Andes, uma universidade particular com uma infra-estrutura sensacional (em alguns quesitos ganhava de “lavada” na USP), sendo uma das maiores universidades Colombianas.
Terraço ecológico da Universidade dos Andes. A infra-estrutura de lá é sensacional – só não é de graça!
Antes do evento em si, tínhamos que fazer o check in da inscrição para ganhar os cacarecos tradicionais de congressos. Foi o nosso primeiro contato com os outros times e também quando caiu a ficha de muita gente: “caramba, é o iGEM!”.
O pessoal do nosso time fez me sentir meio POP por me dizerem que haviam duas pessoas me procurando lá já de cara. Minha reação mental habitual já engatilhou um “Não fui eu!”, mas descobri que se tratava da querida Meagan Lizarazzo (organização do MIT) falando sobre minha inscrição que ainda não havia sido paga e do professor de Eng. Genética da Federal de Manaus, prof. Carlos Nunes, com quem trocava emails há tempos sobre Biologia Sintética. O prof. Carlos Nunes acabou sendo o nosso “orientador postiço” lá. Ele deu um ótimo apoio psicológico e acadêmico durante todo o evento. Conversamos sobre projetos, ideias e principalmente sobre o futuro time da federal de Manaus no iGEM de 2013! É realmente uma honra enorme poder ter feito parte do estímulo para o nascimento dessa nova iniciativa brasileira na competição. 🙂
Times Participantes
A regional latina é a menor das regionais. Nesse ano, apenas 13 times da região centro-sul (incuindo o méxico) da América se inscreveram na competição. Em comparação com o resto do mundo, houveram 60 times norte-americanos, 51 times asiáticos e 49 times europeus. A maioria dos times latinos era mexicano: 6 times; seguindo o retrospecto de tradição desse país no iGEM, um dos primeiros da América Latina a fazer parte de um dos eventos. Esse ano foi o de estréia de outros dois países na cometição também: Chile (que chegou “metendo-o-pé-na-porta” no iGEM) e Argentina.
Após a inscrição, nos disponibilizaram uma sala e pizzas para treinarmos nossa apresentação. Ainda estávamos treinando para falar tudo no tempo de 20 minutos de apresentação que taríamos – nos treinos ainda estávamos estourando uns 5 minutos. Nesse momento o Carlos sacou seu celular e fez um pequeno registro do momento – quando ainda estávamos decidindo como íamos dividir as tarefas e ensaiar a apresentação.
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Diferenças Culturais
Foi muito interessante observar o quanto nós éramos culturalmente “isolados” do resto dos times participantes. Víamos uma integração cultural muito grande entre os outros países da América Latina. Além do fato de falarem a mesma língua, eles compartilhavam gostos musicais parecidos e habilidades que nós brasileiros não temos, como dançar mambo e todos aqueles gêneros musicais tipicamente estereotipados como “latinos”, isso sem falar no “fenótipo médio” deles: nós tínhamos muita “cara de gringo” comparado com eles. Talvez o único outro time que compartilhava uma boa diferença cultural com os amigos andino-caribenhos foi o dos argentinos – com também “cara de gringo” que não manja dos mambos.
Conversei bastante com o time panamenho, um da universidade de Monterrey e com o time argentino. Aliás, o time argentino tinha um projeto (veja aqui, na wiki deles) com a mesma aplicabilidade que o nosso de Redes de Memória Associativa. Basicamente o nosso projeto era algo lindo e abrangente na teoria mas ambicioso demais na prática, o deles ela lindo e factível na prática, mas limitado na teoria (e portanto com uma abrangência de aplicabilidade menor).
Os abstracts que recebemos de todos os projetos do evento podem ser baixados aqui.
Apresentações que Assistimos
As apresentações dos trabalhos foram divididas em duas salas com duas comissões julgadoras diferentes, fomos os terceiros a apresentar (veja o cronograma do evento).
UANL Mty-Mexico
A primeira apresentação foi de um dos times mexicanos. Foi a grande “injustiça” do iGEM regional. Eles vieram com um projeto lindo e extremamente completo, mas não puderam medalhar porque um de seus instructors não preencheu corretamente os formulários online – segundo o que os próprios membros do time mexicano nos disseram, ao encontrá-los no aeroporto. É daqui que vem uma das “coisas que aprendemos” que listei no post anterior. Se eu tivesse feito parte desse time estaria chorando lágrimas de sangue.
Foto da UANL apresentando sob nossa perspectiva.
Apesar da ideia do projeto não ser inédita, eles criaram um detector de arsênico com um design muito inteligente (para os irônicos de plantão: isso não é um trocadilho), indo além do simples sensor feito em 2006 pelo time de Edinburgo. Eles criram um sistema de segregação do arsênico com uma metaloproteína humana (rhMT) bem melhor que o time de Edinburgo de 2006 (que usava o fator de transcrição ArsR), pois a rhMT se liga a seis moléculas de arsênico, enquanto o ArsR se liga apenas a uma. Otimizaram também a internalização de arsênico pelas células expressando a porina GlpF, que além de facilitar o transporte de glicerol (qualidade por qual é mais conhecida), também importa arsênico (e antimônio! Mas isso não vem ao caso). E para coroar (o que eu acho que foi o mais interessante), eles criaram um sistema de recovery das bactérias com o arsênico captado: expressaram a proteína ribossomal L2 nas membranas das E.coli, essa proteína se adere fortemente à superfícies de sílica; assim, as bactérias poderiam ser retiradas do meio por beads de sílica ou qualquer outra coisa de mesmo material! Vale a pena dar uma olhada na wiki deles (que aliás, está completíssima e muito bonita) para também saber mais dos sistemas de expressão de proteínas de membrana. E só para finalizar, eles ainda fizeram uma Human Practices “monstruosa”: criaram workshops de Biologia Sintética e Modelagem de Sistemas Biológicos, deram conferências, organizaram palestras, foram a umas 5 High Schools, criaram um evento que uniu outros times do iGEM, chamado “Synthetic Rally“; criaram outro evento chamado “Túnel da Biologia Sintética“… Enfim: fizeram tudo e “um pouco mais” que podiam fazer em Human Practices. Deu dó eles não terem levado medalha por causa de uma bobeira – com certeza eles iriam para Boston e se dariam muito bem por lá.
Panama INDICASAT
O projeto deles tinha uma aplicação importante, mas que também já não era tão novidade assim no iGEM: em 2007 o time Southern Utah fez exatamente a mesma coisa e ainda levou ouro!
Apresentação de uma das simpáticas meninas panamenhas.
O desenvolvimento de um sensor rápido, barato e não-tóxico de cianeto é bem interessante para detecção desse veneno. Aparentemente eles não conseguiram chegar a resultados que pudessem ir além de acrescentar informações às partes já existentes no Registry of Parts. Eles mostraram todos seus resultados na apresentação, uma vez que a wiki deles não tem informação nenhuma sobre os resultados do projeto. Levaram bronze!
Tec-Monterrey
O Instituto Tecnológico de Monterrey já tem tradição no iGEM. Esse ano veio com dois times, os quais conseguimos assistir ambas as apresentações. O primeiro que assistimos – o Tec-Monterrey EKAM – não veio com muitas coisas novas, além de ter uma wiki e apresentação um pouco “quadradinhas” demais, meio enroladas, sem ir muito direto ao ponto (bem diferente do time da UANL). A grande ideia do projeto desse time é basicamente produzir terpenóides em levedura, aproveitando a via do Mevalonato existente em Pichia pastoris (uma espécie de levedura), que produz os precursores necessários para a síntese dos terpenóides, veja a wiki desse time aqui. Ganharam silver medal!
Wiki do time Tec-Monterrey (e não do Tec-Monterrey EKAM!).
O outro time de Monterrey foi bem mais interessante. Apesar de terem atrasado muito na apresentação e precisarem dar um sprint no final para não estourarem o tempo, o projeto deles foi muito interessante. Mesmo tendo sido em parte outro “repost” no iGEM – o time de Yale em 2011 trabalhou com a mesma coisa. Assim como nós, eles levaram dois projetos diferentes. O “repost” em questão é a tentativa de produção de uma linhagem de E.coli que resista à vários ciclos de congelamento (usando a mesma proteína usada pelo time de Yale), já o projeto original foi a produção de vários alérgenos em levedura para serem extraídos e serem usados como um kit de detecção de alergias. O sangue seria pingado em uma superfície com os alérgenos e em resposta haveria fluorescência verde caso haja resposta alérgica – feito através de uma GFP fusionada ao alérgeno. Legal né!? Dê uma checada na wiki deles aqui. Assim como nós, levaram classificação de prata.
Mas o mais legal mesmo foi poder conhecer a Anita Sifuentes, uma mexicana super simpática que ficou responsável pelo design da wiki do time de Monterrey (o segundo mencionado). Ano que vem ela estará aqui no Brasil e esperamos poder trabalhar com ela! (Tomara que sim!)
No próximo post vou contar um pouco de como foi nossa apresentação e falar dos dois outros times que assistimos depois de apresentarmos. Os vídeos, apresentações e pôsteres da fase regional ainda não estão online, mas os fase mundial já estão. Você pode dar uma checada neles na página do evento!
iGEM 2012 Latin America: Nossos Projetos
Alguns meses a menos de vida para cada um dos dois
Depois de dias no laboratório, noites mal dormidas (vide foto acima), muita teimosia, discussões (construtivas e não construtivas) e principalmente com um pequeno “salto de fé”, nós conseguimos representar o Brasil na competição internacional de máquinas geneticamente modificadas de 2012 (para saber mais do iGEM, veja esse post e esse outro aqui)!
The crew
Antes de falar como foi a experiência, a viagem e tudo mais (próximo post!), vamos falar nesse post sobre o que diabos fomos apresentar lá na Colômbia , como é o julgamento dos projetos e o que nós conseguimos/esperávamos conseguir.
Projetos
Fomos para a competição com dois projetos (o que pode ser entendido desde como algo “arriscado” ou “ousado”, até a “completamente insano”) que já haviamos comentado no blog bem antes mesmo de colocarmos a “mão na massa” em laboratório. A grande estratégia foi ter um dos projetos bem factível, que nos daria uma maior certeza de resultados positivos, e um projeto mais ambicioso, que nos destacaria entre os demais por sua inovação e criatividade – mas que a chance de dar certo não era lá assim tão boa quanto a do outro projeto.
Levamos para o Jamboree (palavra em inglês que significa algo como “reunião de celebração”) o projeto “Plamídeo Plug’nPlay” – o factível – e o “Rede de Memória Associativa usando Bactérias” – o ambicioso.
Plug’nPlay
Basicamente, o Plasmídeo Plug’nPlay é uma maneira mais espertinha de se pegar um gene qualquer e colocá-lo para ser expresso dentro de uma bactéria. Para quem entende melhor do assunto, ao se explicar o projeto o nome de outros sistemas comerciais podem vir à cabeça – como o método Gateway, TOPO e o In-Fusion – mas a grande ideia é: se você tem um gene que quer clonar (ser expresso em algum ser vivo), basta fazer um PCR dele (milhões de cópias do dito cujo) e seguir o protocolo de transformação, como se os pequenos pedaços de DNA lineares fossem um plasmídeo. O plasmídeo Plug’nPlay (já presente dentro da bactéria) cria uma maquinaria para reconhecer esse produto de PCR e inseri-lo no próprio vetor. A grande vantagem desse método é que não existem certos passos que consomem um tempo desnecessário, como certas reações in vitro presentes nos três métodos citados anteriormente. A E.coli faz tudo isso por você!
Quando já estávamos começando a fazer os experimentos, descobrimos um método lançado recentemente pela empresa GenTarget, o método Eco PCR, que faz EXATAMENTE a mesma coisa: PCR e transformação – dois passos: “Plug” e “Play”. Contudo, existem duas diferenças entre o Plug’nPlay e o Eco:
- o Plasmídeo Plug’nPlay usa uma recombinase, enquanto o Eco PCR usa recombinação homóloga;
- o Plug’nPlay é Open Source!
Conseguimos resultados bem legais com esse projeto, mostrando uma prova de conceito que indicava a recombinação do produto de PCR com o Plasmídeo Plug’nPlay! Veja isso na nossa wiki, aqui.
Rede de Memória Associativa
Essa foi a aposta ousada do nosso time. Eufemicamente “ousada”.
Tudo parte de uma pergunta muito provocante: bactérias podem se comportar como neurônios para manter e lembrar uma memória!?
Toda dificuldade em explicar esse projeto está em tentar responder essa pergunta. Há várias “subperguntas” a serem respondidas dentro dessa, como: o que é (pragmaticamente) um neurônio!? O que é uma memória? Como é armazenada? Como se resgata uma memória!?
A memória do nosso cérebro não existe em “um neurônio”, e nem mesmo fica dividida literalmente em pedacinhos dentro de vários neurônios (pode até ser de fato, dependendo de como você interpreta “dividir em pedacinhos”). Ela é “sistêmica”, o que significa que você só consegue alcançar sua memória se todo um grupo de neurônios se comportar de uma maneira específica – ativando e/ou inibindo outros neurônios da rede.
Enfim, essa é a ideia do projeto: fazer populações de bactérias se comportarem como um neurônio, podendo ser “excitadas” ou “inibidas”, e podendo “excitar” ou “inibir” outras populações – igual ao que um neurônio faz com outros neurônios. A(s) memória(s) seria(m) definida(s) quando “programássemos” geneticamente as populações para interagir entre si.
Se tivéssemos conseguido produzir isso completamente, teríamos a base para construir uma rede de comunicação entre as populações de bactérias, que seria análoga a uma rede de comunicação entre neurônios. À partir daí, seria possível criar um sistema que, dado um padrão de estímulo de populações inicial, poderia associar esse estímulo a uma das memórias do padrão de comunicação entre as populações, que já tinham sido “pré-programadas” com a memória.
Complicado né!? E só descrevi bem brevemente a ideia. Imagine ter que apresentar toda essa densidade de conteúdo em menos de 10 min!? E olha que eu nem mencionei o modelo de Hopfield para redes neurais, o aparato que teríamos que testar para ver o sistema funcionando e muito menos como funciona o sistema de Quorum Sensing. Acho que até mesmo Steve Jobs teria dificuldade em vender essa ideia.
Apesar de não termos conseguido finalizar as construções para realizar os experimentos, conseguimos fazer uma modelagem interessante do sistema, que mostra que para dois neurônios, há teoricamente quatro pontos de equilíbrio do sistema, o que indica – pelo menos teoricamente – que há o armazenamento das quatro memórias distintas num sistema simplificado. Na verdade, faltou fazer a análise da estabilidade desses pontos de equilíbrio, mas isso é outra história.
Se tudo o que planejamos desse hipoteticamente certo, poderíamos ter criado a prova de conceito para um sistema de auto-monitoramento de biorreatores, em que quantidades específicas de substâncias seriam mantidas nas devidas proporções através de um sistema de memória associativa que reestabeleceria sempre as concentrações das substâncias em questão, caso haja alguma alteração devido à fatores aleatórios do cultivo. Veja uma explicação melhor do projeto e até onde chegamos através da nossa wiki.
Resultados
Apesar de não termos chegado a resultados com o projeto de Redes, conseguimos “consertar” um BioBrick com erro e mostramos que o Plug’nPlay funciona, por isso conseguimos levar medalha de prata!
Para o incauto viajante, pode parecer claro que isso não é um bom resultado. Afinal “merecíamos ouro!”, “o time é da USP!” (ohh!), “a Unicamp foi melhor antes!”…
Particularmente, eu já esparava que o ouro fosse pouco provável. Não porque somos ruins, mas porque há uma condição necessária para levar o título áureo: a melhoria de novas partes e/ou novos devices (que são novas combinações de BioBricks já existentes). A maioria dos times de sucesso (a.k.a. europeus, norte-americanos e chineses) pesquisa os elementos de DNA desejados na literatura e manda sintetizá-los, o que agiliza muito o processo de redesign de BioBricks e viabiliza construções muito grandes. Não tínhamos verba o suficiente para a síntese, o que dificultava muito a criação de um device novo funcional, que seria construído no projeto de Memória Associativa. É lógico que existem outros fatores envolvidos para ganhar a classificação de medalha de ouro, mas escolhendo um como principal – aquele que, se diferente, poderia mudar bastante coisa – acho que seria esse: síntese de DNA. Infelizmente os devices do Plug’nPlay que construímos não foram considerados como “improvements”, mas apenas como uma caracterização funcional de uma nova parte/design. 🙁
Portanto, para mim, a briga estava mesmo se íamos levar prata ou bronze, porque ainda precisávamos de mais um dado para mostrar com um maior grau de “inequivocidade” que o Plug’nPlay funcionou. Mas parece que conseguimos convencer os juízes. 😀
O que aprendemos
A primeria coisa que aprendi nisso tudo foi: não se mede o desenvolvimento e os resultados de um projeto vendo apenas onde se chegou, mas de onde se saiu e até onde se foi.
O que vale mesmo é o Delta!
Tudo começou no início de 2011, e depois recomeçou no segundo semestre do mesmo ano à partir do zero (pra não dizer à partir do “negativo”). Não tínhamos nada além da vontade de fazer acontecer. Conhecemos pessoas, o grupo cresceu e se fortaleceu, discutimos ideias, firmamos parcerias, criamos projetos, arrecadamos verbas, aprendemos uma infinidade de coisas como: design, marketing, gestão de pessoas, planejamento, análise de viabilidade de projetos, web design, programação, resolução de problemas do dia-a-dia em laboratório… Enfim, fizemos muitas coisas que muita gente duvidava no início de tudo – acho que até eu duvidava!
Outras coisa menos subjetivas que aprendemos principalmente através do feedback que recebemos dos juízes – e que podem ajudar futuros times brasileiros do iGEM – foram:
- Os BioBricks são o foco, o resto do projeto em si é apenas o complemento da caracterização deles.
- Os projetos que vão além da mera caracterização dos BioBricks são os de mais sucesso – parece contradição com a conclusão anterior, mas não é: experimentos de caracterização e experimentos de funcionalidade de um projeto devem ser complementares; os dois não são sempre necessariamente a mesma coisa.
- Apresente a apresentação do Jamboree para o maior número de pessoas possível (de preferências professores da área) antes da apresentação fatídica: assim você consegue imaginar todas as perguntas possíveis que podem fazer para seu projeto – na verdade, isso vale para qualquer apresentação importante na sua vida.
- Na modelagem: vá além de equações diferenciais.
- Descreva bem os materiais usados e os protocolos na wiki!
- Seja criativo e tente criar projetos de impacto no “mundo real”.
- Tente criar uma Human Practice que tenha contato direto com as pessoas, de uma maneira criativa.
- Foque nos resultados e em como eles foram feitos.
- Ajude outro time do iGEM.
- Fiscalize os outros times latinos para falarem INGLÊS e não ESPANHOL no Jamboree da América Latina(importante!) – haha.
- Nunca, em hipotese alguma, JAMAIS preencha os documentos de inscrição/submissão de partes com pressa ou sem atenção. Esse ano houve um time mexicano que não medalhou por falhar nesse quesito.
Futuro dos Projetos
Como parte da iniciativa do Clube de Biologia Sintética, queremos estimular a criação de projetos em Biologia Sintética não unicamente para o iGEM, mas para virarem publicações científicas ou empreendimentos mesmo. A competição é uma ótima plataforma para testes piloto de projetos e ideias, principalmente por contar com o acervo dos BioBricks e com a interação da comunidade internacional envolvida na área. Por isso, faz parte do nosso trabalho levar esses projetos além, fazer com que cheguem até ao “produto final”.
O plasmídeo Plug’nPlay ainda está sendo desenvolvido e testado no GaTE Lab visando futuras aplicações comerciais. O projeto de Redes está engavetado até definirmos o projeto do iGEM do ano que vem, mas há grande interesse de darmos continuidade a ele, principalmente por parte do pessoal da modelagem. Estamos com alguns contatos que podem se interessar em criar oportunidades para fazer essa rede de memória associativa com bactérias funcionar – muitos acharam interessantíssimo o nosso projeto no Jamboree, foi muito estimulador.
No próximo post vou falar de como foi a viagem a Bogotá e quais foram as impressões da competição para o único time tupiniquim deste ano. iGEM 2012 Latin America: Estivemos lá!
Enquanto isso, vejam nos comentários aí embaixo se meus comapnheiros concordam comigo sobre esse post (não me deixem no vácuo)! Hahaha! Até!
Microalgas na Biologia Sintética
Na penúltima reunião do Clube de Biologia Sintética foi discutido em que pé andam as pesquisas envolvendo microalgas – uma das milagrosas fontes energia sustentável e fixação de CO2 – no contexto da Biologia Sintética. O apresentador da vez, João Molino, com base nos conhecimentos que vem adquirindo no seu doutorado na Farmácia (FCF) aqui na USP, nos deu um review dos trabalhos com microalgas usadas em Biologia Sintética, além de falar um pouco de como as microalgas são incríveis para converter energia solar em bioprodutos e – consequentemente – fixar CO2. Com isso ele sugere no final algumas oportunidades que poderíamos usar para projetos do iGEM do ano que vem.
Vídeo com “Pipotecnica”
Como tivemos problemas envolvendo a transmissão da reunião (que já era feita de maneira precária), resolvemos gravar novamente a apresentação, só que desta vez utilizando uma nova pirotecnia dos vídeos da internet, o Popcornmaker (veja mais sobre ele nessa palestra de 4min no TED). Junto ao vídeo irão aparecer muitos links e informações extras diretamente da wikipédia em inglês (nunca substimem a wikipédia em inglês!), portanto se quiser saber mais sobre alguma informação “ao vivo” durante o vídeo, cheque os links! [clique na imagem abaixo para ir ao vídeo em outra aba]
Anotações Pessoais
Apesar do custo/benefício das pesquisas de microalgas na indústria não ser muito bom – segundo o que o Mateus me contou outro dia – suas características são muito provocativas para serem usadas como solução ecológica para muitos problemas e melhorar bastante processos de produção de bioprodutos já existentes. Ela faz coisas simplesmente incríveis. Como o João mostra no vídeo, ela é campeã na produção de galões/acre de óleo, além de poder viver em ambientes completamente isolados, como em uma garrafa fechada por exemplo – diga aí, qual ser vivo que você encontra no seu dia a dia (sem contar microalgas né…) que consegue viver muito bem e por muito tempo num ambiente completamente fechado e sem ar! Ela também fixa CO2 que é uma beleza, produz hidrogênio (hidrogênio cara!) e ainda pode ser usada como biorremediador (e de fato é naturalmente) para limpar áreas contaminadas!
Além de ser muito interessante biotecnologicamente, as microalgas são um grande gargalo na biologia sintética devido à falta de BioBricks e de elementos de DNA padronizados, como suas sequências terminadoras. O que é bem legal para o Registry of Parts e para o iGEM: partes inéditas! O time do chile do iGEM deste ano foi um dos primeiros a conseguir transformar cianobactérias (“parentes” das microalgas) com sucesso utilizando BioBricks na competição, o que é um bom indício para se trabalhar com microalgas.
O Grande Desafio
Apesar disso tudo, trabalhar com microalgas é algo bem desafiador, muito por causa do item mais valioso que se tem em laboratório: tempo. Um processo inserção de vetor nas células que duraria apenas (no máximo!) 2 dias de trabalhando com E.coli, com nossas amigas verdinhas duraria cerca de uma a duas semanas (se não me engano, segundo o que o João me contou). Para se fazer um projeto desse tipo estaríamos um pouco limitados para o pouco tempo do iGEM, a não ser que nos organizássemos muito bem (ainda estamos trabalhando nesse quesito). Mas o interessante é que aparentemente elas são bem geneticamente estáveis quando se tratando do vetor inserido; pelo o que o João nos contou, algumas microalgas transformadas duram anos com o seu novo pedaço de DNA. O processo de transformação também é aparentemente tranquilo e sem muito mistério.
Seguindo com os nossos objetivos de criar um projeto para o iGEM, muitas ideias surgiram da potencialidade de trabalhar com microalgas. Particularmente, comecei a pensar num sistema em que as microalgas “alimentassem” uns extremófilos, para que eles produzissem um efeito desejado com suas habilidades únicas da natureza – habilidades extremas! Mas discorro sobre isso em futuros posts.
Referência Principal
Durante o vídeo, muitas referências interessantes apareceram com ajuda do Popcornmaker, mas a referência principal que guiou o overview que o João nos fez é essa aí embaixo:
- Wang B, Wang J, Zhang W, & Meldrum DR (2012). Application of synthetic biology in cyanobacteria and algae. Frontiers in microbiology, 3 PMID: 23049529
Clube de Biologia Sintética 2012
Começaremos novamente nesta quarta feira (15 de agosto) as reuniões do Clube de Biologia Sintética!
Não importa a área: se você se interessar por biotecnologia, pesquisa interdisciplinar, gosta de aprender coisas novas e de resolver desafios, está mais que convidado!
Você de Exatas
No Clube você pode descobrir um novo mundo para “programar”, modelar e resolver problemas utilizando conceitos de engenharia para se fazer o design de sistemas biológicos.
NOTA: Nesse ano colocamos um Físico em um laboratório de Biologia Molecular; foi mais ou menos assim:
[youtube_sc url=”http://www.youtube.com/watch?v=3drspKkfIyE”]
Você de Biológicas
Nas reuniões você pode descobrir que a Biologia pode ser muito mais exata do que você conhece, e a diferença é só de abordagem.
E qual o Objetivo de Tudo Isso!?
Usar criatividade, interdisciplinariedade e empreendedorismo para esboçar um projeto para a competição internacional de máquinas geneticamente modificadas de 2013! E se divertir no processo, é claro!
A ideia é gerar propostas para serem apresentadas nas reuniões à partir de brainstormmings e referências indicadas por qualquer participante do grupo. É uma oportunidade de se aprender a como se iniciar um projeto do zero, planejar experimentos, verificar viabilidades, procurar materiais, custos, buscar financiamento, organizar pessoas, tempo e recursos; ou seja: tudo o que você precisa para se dar bem em qualquer empreendimento.
Já temos um pequeno cronograma ainda com detalhes a definir, mas com temas já escolhidos. Depois disso quem fará as reuniões serão os próprios participantes, convidados a apresentar suas ideias, assuntos interessantes e relevantes de synbio e qualquer outra coisa que se encaixe na reunião.
Nosso projeto para o iGEM 2012 ainda não acabou, mas vamos trazer toda a experiência que estamos acumulando para melhorar ainda mais ano que vem!
Horário: Das 18:30 às 20:00 hrs
Local: Sala “Fava Netto”, do ICB II – USP.
Vamos transmitir a reunião por Livestream. Colocaremos o link no facebook, twitter e aqui no blog quando iniciarmos a transmissão. Fiquem ligados!
A Incrível Sociedade dos Microrganismos
É bem óbvio que um ser humano não existiria sozinho. Não só porque ele não poderia ser gerado, mas porque dificilmente conseguiria sobreviver. Já reparou na quantidade de pessoas que permitem (e permitiram) que você tivesse o dia de hoje como você tem? Cada parafuso, tecido, metal, tijolo e etc que permite você estudar, trabalhar, andar de automóvel, comer e ler esse texto foram pensados, feitos, montados, transportados e vendidos por alguém. Não é possível portanto tentar entender os humanos, bem como a maneira com que eles se comunicam, isoladamente. É preciso olhá-los sistemicamente, como seres sociais. As bactérias também. É cada vez mais reconhecido que as bactérias não existem como células solitárias, mas são como um “organismo colonizador” que elabora complexos sistemas de comunicação que facilitam a sua adaptação às recorrentes mudanças ambientais. E elas nascem poliglotas. A seleção natural esculpiu em diferentes espécies diversos genes que as permitem se comunicar cooperativamente e repressivamente entre espécies e até mesmo entre reinos (como por exemplo em bactérias patogênicas). Damos à essa comunicação bacteriana o nome de “quorum sensing” (“detecção em quórum” – tradução livre).
Quorum Sensing
O termo “quorum sensing” foi cunhado devido à habilidade dos microorganismos expressarem ou aumentarem a expressão de certos genes quando em grande população, podendo dessa forma monitorar a densidade celular (quantidade de células ao seu redor) antes de manifestar algum fenótipo. Um dos exemplos mais ilustrativos disso é da Dictyostelium discoideum, um protozoário que passa uma das fases do seu ciclo de vida produzindo um corpo multicelular. Tem um vídeo bem legal mostrando a formação de um corpo de frutificação através de várias células individuais de Dictyostelium:
[youtube_sc url=http://www.youtube.com/watch?v=vjRPla0BONA]
Reparem rapidamente em 00:30 min as células se locomovendo em “pulsos”, na direção de um local em que todas estão se agregando (é difícil de perceber!). Esse local inicial é em geral onde um grupo de bactérias encontrou alguma fonte de nutrientes. A “pulsação” da locomoção das bactérias acontece devido à substância de quorum sensing que é difundida pelo espaço vinda das células do local de agregação; um pulso inicial provoca – quando em uma população não muito grande, para ser perceptível – um comportamento oscilatório de resposta das células: quando uma célula recebe um sinal (do tipo “Ei, tem comida aqui!”), ela emite um de volta (como se etivesse gritando “Caramba, tem comida lá!”), que é recebido pelas células que mandaram o sinal incialmente (o que seria um “Ótimo! Estou indo praí!”) e por outras ao seu redor, propagando o sinal. Como a transmissão de informação com as substâncias não é imediata e nem totalmente contínua, observa-se os “pulsos”, que são resultado do “gap” entre enviar e receber informações pela difusão de moléculas.
As diferentes Línguas das bactérias
Tabela com exemplos das diferentes famílias de substâncias de QS, as diferentes "línguas" das bactérias. Imagem modificada de S. Atkinson e P. Williams (2009) e de Y. He e L. Zhang (2008). Referências no final do post.
As “línguas”, ou simplesmente certas coisas que as bactérias querem “dizer” (como “Estou afim de dar uma reproduzida!” ou “Fujam, eles estão vindo!”) são “ditas” através de diferentes tipos de substâncias que os microorganismos produzem. No caso da Dictyostelium ali em cima, a substância é AMP cíclico (é quase um ATP, só que duas vezes menos fosfatado… e cíclico, é claro), mas se tratando de bactérias – que ainda é a principal plataforma de aplicação da Biologia Sintética – existem três tipos principais de substâncias de quorum sensing: as acil-homoserinas lactonas (HSL ou AHL), auto-indutores 2 (AI-2) e pequenos ácidos graxos, chamados de “DSF”s (Diffusible Signal Factor – do inglês: Fator Sinalizador Difusível). Existem ainda outras famílias de substâncias de QS, mas aparentemente menos comuns que essas três principais.
O Mecanismo Gênico
A ativação dos sistemas de QS só ocorre em uma alta densidade celular. Isso permite que se chegue uma concentração limiar de substâncias de QS para expressão de genes. 1, 2 e 3 são os três elementos básicos de DNA para se construir um sistema de QS. Imagem modificada de NA. Whitehead et al (2001), referência no final do post.
Para um microrganismo ganhar a abilidade de “falar em outra língua”, em geral são necessários apenas três elementos de DNA: um gene que gere uma enzima que produza uma substância de QS, outro gene que produza o “receptor” dessa substância – que em geral é um fator de transcrição – e um promotor, no qual o fator de transcrição (após se associar à substância de QS) se liga para controlar a expressão gênica (imagem ao lado).
Se uma bactéria (por exemplo) “fala” a mesma “língua” que suas companheiras de colônia, como ela diferenciaria então um sinal próprio (a própria substância de QS sendo produzida) de um sinal de outras células (substância de QS externa)!? Isso é importante, porque se a bactéria receber o próprio sinal que envia, ela entrará em um processo autocatalítico que resultará em uma contínua auto-ativação da célula independente do sinal das bactérias ao seu redor. Acontece que uma bactéria não produz níveis suficientes de QS para “se ouvir”. Sem o sinal externo, a transcrição de genes pelo sistema de quorum sensing é fraca e insuficiente para iniciar um feedback positivo; apenas em alta densidade celular se consegue alcançar uma concentração crítica de substâncias de QS para estimular a transcrição dos genes que o QS controla.
Quorum Sensing no iGEM
Apesar de não ser um meio de transmissão de informação tão rápido e eficiente como o dos light switches, os sistemas de QS são bastante utilizados em dispositivos sintéticos devido à sua especificidade e falta de “falsos sinais” – afinal, é extremamente fácil estimular não-intencionalmente uma célula sensível à luz. No Registry of Parts existem cerca de 6 sistemas de QS completos, padronizados e disponíveis para construção, todos usando (em geral) diferentes AHLs, usados tanto na ativação e inibição da expressão de genes.
Exemplos de utilização desse sistema de transmissão de informação não faltam no iGEM. Já tratamos no blog de um dos inúmeros projetos do iGEM que utilizam quorum sensing, o da Unicamp de 2009. Em seu projeto, o time brasileiro utilizou sinais de AI-2 como um “sistema de alerta” em bactérias produtoras de bioprodutos em um bioreator. Quando um microrganismo contanimante surgisse (produzindo AI-2), o sistema de QS atuaria para comunicar sua presença a todas as bactérias ao redor do organismo invasor, iniciando gatilhos gênicos para produção de substâncias nocivas ao contaminante, afim de exterminá-lo do bioreator.
Parte do vídeo explicativo do time da Unicamp de 2009. Uma pequena esquematização de como usaram quorum sensing.
Aprender como uma população de microrganismos de comunica é extremamente útil para saber como ela se comporta, e no caso da biologia sintética, muito útil para conseguir controlar esse comportamento para transmitir informações em um dispositivo gênico sintético. Mas é claro que prever todo um comportamento de um sistema biológico não é nada fácil. Como já salientava Asimov, há algo em comum no comportamento de humanos e átomos: ambos são muito previsíveis singularmente, mas praticamente caóticos quando em coletivo. Apesar de mais simples, populações de microrganismos também se comportam assim, o que é uma das razões que tornam o trabalho em laboratório muitas vezes frustante e cansativo. Um guia nesse caos é essa compreensão sistêmica da comunicação entre bactérias (que origina certas resistências a antibióticos inesperadas e outras coisas bizarras), que assim como seres humanos, as torna seres mais sociais do que você possa imaginar.
Referências
- Whitehead, N. (2001). Quorum-sensing in Gram-negative bacteria FEMS Microbiology Reviews, 25 (4), 365-404 DOI: 10.1016/S0168-6445(01)00059-6
- Atkinson, S., & Williams, P. (2009). Quorum sensing and social networking in the microbial world Journal of The Royal Society Interface, 6 (40), 959-978 DOI: 10.1098/rsif.2009.0203
- He YW, & Zhang LH (2008). Quorum sensing and virulence regulation in Xanthomonas campestris. FEMS microbiology reviews, 32 (5), 842-57 PMID: 18557946
Enquete: Qual projeto você acha mais interessante!?
Chegamos ao fim do ano com três projetos bastante interessantes para levarmos ao iGEM e queríamos a opinião de vocês sobre qual deles vocês acham mais legal e o porquê! Deêm uma conferida num resumo super rápido de cada proposta:
Plasmídeo Plug&Play
Cansado de ter que fazer vários passos metodológicos para transformar microrganismos? Você adoraria expressar um gene que você sempre quis em sua bactéria de um jeito fácil, rápido, barato e acessível? Chegou a solução! Com apenas dois pequenos passos você tem em mãos um kit de transformação “faça-você-mesmo” (DIY), sem precisar de equipamentos e reagentes caros! Basta fazer um PCR e depois a transformação! Esqueça outros passos como digestão, ligação, e vários outros PCRs cansativos! Veja aqui o link de um vídeo sobre a proposta.
Rede de Memória Associativa em Bactérias
Imagine se fosse possível reproduzir um comportamento cerebral… sem o cérebro! Esse é um tipo de desafio que muitos cientistas da computação e programadores andam trabalhando por aí. Na Biologia Sintética também! Inspirado em algumas publicações recentes envolvendo experimentos in vitro de sistemas com comportamento de uma rede neural, queremos criar um modelo in vivo disso, e sem usar neurônios: com populações de bactérias! Elas seriam capazes de reconhecer um padrão luminoso incompleto de uma “memória” que possuem e depois completar esse padrão, dando uma saída (output) luminosa com o padrão mais próximo de sua memória em relação ao padrão inicial dado. Já escrevemos um post sobre o caminho de ligações improváveis que fizemos para chegar na ideia desse projeto. Veja aqui o link de um vídeo sobre a proposta.
Sensor de Tensão Mecânica de Membrana
Nós temos mecanismos sensoriais bem parecidos dos que existem em microrganismos. Basicamente eles podem ser: metabólitos, temperatura, luz, voltagem, e até mesmo campos magnéticos. Mas e o “tato”!? Aquele tipo de sensor que usamos a todo momento! Como fazer microrganismos traduzirem um contato físico em uma resposta (igual por exemplo à essa plantinha aqui)!? É o que propõe a ideia desse projeto. Propor um novo sensor que pretende fazer microrganismos nos contarem que os estamos tocando (através desse Biobrick, um “stretch channel”), emitindo luz azul nesse processo (através desse Biobrick, Aequorina). No final, podemos aplicar isso igual ao esquema da figura aí em cima. Veja o link de um vídeo sobre a proposta aqui (< desatualizado, mas no mínimo dá pra entender de onde veio o insight da ideia).
E aí!? O que você acha? Dê o seu pitaco!
Ligações Improváveis: RNA antisense, Sudoku e Redes Neurais
A ciência é cheia de ligações improváveis.
Veja por exemplo o estudo das partículas subatômicas e seus spins: quem diria que conhecer isso poderia permitir uma revolução na neurociência? Entendendo como o núcleo atômico dos átomos se comporta em um campo magnético foi possível construir o aparelho que permite literalmente olhar dentro de nosso cérebro, passando bem longe de um desconfortável bisturi: o aparelho de Ressonância Magnética Nuclear Funcional (geralmente os hospitais e clínicas tiram o “Nuclear” do nome porque isso assusta os pacientes; é sério!).
Chamamos essas ligações de “improváveis” principalmente por causa da sua contra-intuitividade, afinal quem pensaria em analisar o comportamento de cérebros ao se estudar algumas das menores coisas do universo!? Fazer essas pontes é o que se precisa para criar inovação, e é exatamente na busca desse tipo de coisa que nas últimas reuniões do Clube de Biologia Sintética começamos a fazer algumas ligações (não necessariamente na ordem do título) que “do lado de fora” têm uma aparência improvável, mas que no fundo talvez só sejam contra-intuitivas.
Tudo começou, ou melhor, tudo deveria ter começado (para amenizar a aparente desconexão) falando-se da mais novinha regulação de expressão gênica no mundo das descobertas científicas:
O RNA de Interferência
Representação do funcionamento dos RNAs antisense: quando se ligam à uma fita de RNA mensageiro com alto grau de complementariedade entre as fitas (diz-se "complementariedade" entre duas fitas de DNA (ou RNA) quando o código genético de ambas têm sequências de nucleotídeos que ligam-se entre si através dos pares A-T (U em RNAs) e C-G formados entre as fitas), há o bloqueiro da atuação da RNA polimerase, impedindo a tradução do RNA em proteína. Se não houver muita correspondência entre as fitas de RNA a traduação continua normalmente.
É mais uma daquelas descobertas “nobélicas”, estudada pelos pesquisadores americanos Andrew Fire e Craig Mello em 1998, ganhando o prêmio em 2006. A grande ideia dos RNAs de interferência (iRNA) é o pareamento de pequenos segmentos de RNA – que não são codificados em proteínas – com RNAs mensageiros, impedindo que sejam traduzidos por “bloquear” o ribossomo . Esse sistema de inibição gênica envolve várias enzimas (se quiser saber mais veja esse ótimo vídeo) e é um pouco mais complexo do que o sistema de regulação gênica daquilo que chamamos de RNA antisense, mas na essência funcionam do mesmo jeito: bloqueio da tradução através de um RNA antisense complementar. A grande diferença entre os RNAs antisense e os de interferência, que são comumente confundindos com sinônimos, é que os iRNA atuam através de toda uma via de reações enzimáticas em eucariotos, enquanto os RNA antisense são mais característicos de seres procarióticos e não precisam de uma via enzimática para regularem a expressão gênica.
Diferentemente dos outros tipos de regulação mediados por inibidores, que são basicamente proteínas que se ligam ao DNA inibindo a transcrição gênica, com os RNAs antisense têm-se uma gama muito maior de inibidores da expressão gênica. Imagine que você quer controlar uns 2 ou 3 genes em uma bactéria: existem muitos metabólitos que podem fazer esse trabalho (por exemplo IPTG, galactose, TetR e etc.), mas e se você quiser ter um controle de mais genes, digamos, uns 20!? Dá-lhe repressores! Por outro lado, se for possível usar RNAs de interferência suficientemente eficientes, poderia se fazer um vetor de transformação bem mais enxuto (em relação aos sítios repressores) além de poder construir um mecanismo de repressão mais orientado ao “alvo” de repressão: basta construir um RNA mensageiro complementar. É exatamente essa versatilidade que torna possível contruir uma…
Bactéria Resolvedora de Sudoku
Legal: Sudoku, Bactérias e RNA antisense… O que essas coisas têm a ver!?
Essa grande ideia veio do time japonês UT-Tokyo do iGEM de 2010, e além de usar RNAs antisense, também usou do dispositivo gênico baseado em recombinases semelhante ao que o time da Unicamp usou em 2009 para a mesma finalidade, que é diferenciar diferentes populações de bactérias. O sistema que eles criaram funciona basicamente assim:
Populações Diferentes
Diferentes tipos de Populações
Eles representaram (em um sudoku 4×4) cada posição por uma população específica de E.coli’s. Cada posição tem algo em seu DNA que a torna diferente de todas.
Diferentes Estados
Estados das Populações
Cada população pode se diferenciar em quatro tipos diferentes de E.coli’s correspondentes à cada número que um sudoku 4×4 permite (1, 2, 3 e 4).
Comunicação entre as Posições (Populações)
Comunicação viral entre as posições (populações) do sudoku
As populações devem se comunicar para transmitir a informação de suas posições para as outras posições; afinal é assim que se resolve um sudoku: podemos dizer que uma posição é 1, 2, 3 ou 4 depois de recebermos as informações de quais números existem no quadrado, linha e coluna correspondente à posição em questão.
Essa comunicação é feita através de vetores virais, que são vírus que as bactérias produzem para infectar as outras populações correspondentes às outras posições, transmitindo as informações que possuem (como sua “posição” e “estado”: 1, 2, 3 ou 4).
Diferenciação dos Estados
Diferenciação dos estados
Para o sudoku funcionar, quando uma posição identificar qual é o estado de suas vizinhas, ela deve se diferenciar justamente no estado que não recebeu sinal. Por exemplo (imagem ao lado), se a posição (1,1) (linha 1, coluna 1) receber as informações de que certas posições em seu quadrado, linha e coluna já estão diferenciadas nos estados 3, 2 e 1, ela deve se diferenciar em 4. Para conseguir fazer isso, os japoneses usaram o dispositivo chamado “4C3 leak switch”, que se baseia na probabilidade de uma polimerase em “ignorar” os sítios terminadores de transcrição. Para entender melhor, veja a imagem abaixo:
Cada gene codifica um tipo de recombinase (as setinhas apontando para a esquerda: Hin, flpe, Ligand 3 e Ligand 4). Quando a E.coli for infectada por um vírus de uma posição com que se comunica, ele inserirá um plasmídeo que expressa uma dessas 4 recombinases, agindo nas posições que flanqueam o mesmo gene na bactéria. Por exemplo, na imagem da diferenciação dos estados, a posição (2,2) envia um vírus à (1,1) passando a informação de que possui o estado “2”, expressando a recombinase flpe e retirando o respectivo gene do plasmídeo bacteriano através das posições FTR que flanqueiam o gene (ver imagem acima). Ao fazer isso, também retirará o sítio terminador que fica entra os FTR, aumentando a probabilidade da polimerase atravessar todas as sequências de recombinases de sequências invertidas e expressar a cre recombinase (setinha cinza apontando para a direita). Depois, se a posição (1,1) receber mais dois vírus diferentes, ele perderá 3 genes de recombinase e três sítios terminadores, restando apenas um sítio terminador entre o promotor pT7 e o gene cre. Nesse estágio, a probablilidade de a polimerase ultrapassar o sítio terminador (daí que vem o “leak”) é considerável, e quando o faz, transcreve a cre recombinase, que retira seu próprio gene e os dois sítios terminadores duplos depois dele, conectando o gene de recombinase que não foi retirado do plasmídeo junto dos genes que também estão em sentido reverso, transcritos pelo promotor pSP6. Além disso promove a produção de vírus através da retirada dos dois sítios de parada que separam o segundo promotor pT7 do gene que transcreve a polimerase que atua no promotor pSP6 e o gene que produz o capsídeo do vírus. O empacotamento das sequências genéticas no vírus acontecem após a loading sequence (retângulo rosa). Isso faz com que a posição 1 passe também a “emitir” vírus informando seu estado e posição.
Para entender de verdade, vale assistir o vídeo (começa mesmo aos 24 seg) que o próprio time japonês fez para mostrar o funcionamento do sistema (percebam o sotaque!):
Restrição de Posições
Para isso dar certo é preciso que somente as populações da respectiva linha, coluna e quadrado comuniquem-se entre si, ou seja, deve have uma restrição à comunicação entre as populações de posições não-relacionadas segundo o sudoku. Como isso é feito!? Sim! RNAs antisense!
Tudo isso só consegue funcionar graças à atuação dos RNAs antisense que coordenam o fluxo de informação entre as diferentes populações associadas às diferentes posições do sudoku. Na imagem do 4C3 leak switch são as location sequence que contém todas as sequências codificantes dos RNAs de interferência de cada posição. Com isso é possível construir uma tabela de correspondência de antisense que dirá quais antisense uma posição deve fazer para inibir a atuação dos vírus de outras posições não-relacionadas:
Mas espera aí! O sudoku é uma tabela 2D, como é possível separar as diferentes populações, uma em cada posição característica, e assim fazer a transferência de informação!? É preciso construir algo físico – uma tabela de sudoku de verdade – para esse sistema sintético!? Resposta: não é preciso “separar” as populações, a interação entre os RNAs antisense dos vírus de cada população que remete à uma posição dá conta do recado. Você pode misturar todas a populações em um tubo de ensaio (com o input, é claro) e depois analisar os estados de cada bactéria pertencente à um tipo de população (por sequenciamento) e assim saber o resultado do sudoku.
Esse conceito de restrição de informação por RNAs antisense, e esse fluxo de informação por vírus é essencial para se entender o que estávamos discutindo no clube de biologia sintética, sobre como fazer em um sistema bactériano uma…
Rede Neural
Por fim: rede neural! Como fazer um dispositivo biológico sintético que imite uma rede neural!?
Bem, abstratamente falando, uma rede neural pode ser simbolizada através da imagem ao lado: os neurônios (as bolinhas) e suas ligações. O que temos em comum entre esses sistema e o sudoku são que temos posições espaciais trocando informações e seguindo um padrão. No sudoku o que restringe o fluxo de informação são as regras que pré-estabelecemos para o jogo, no sistema neuronal o que restringe a comunicação é apenas o espaço (existe um número finito de ligações axônicas que os neurônios podem fazer devido à limitação de espaço), além de outro fator: o “peso” dessas interações, que associa uma intensidade de fluxo de informação entre neurônios (o aumento desses “pesos” durante o tempo devido a um estímulo é o que chamamos de aprendizado).
Rede de Hopfield
Para querer fazer o design de um sistema sintético que se comporte como uma rede
neural devemos usar um modelo que represente uma rede neural! Existem vários deles, mas um mais simples e talvez o mais interessante para usarmos é a Rede de Hopfield, muito usada em computadores para reconhecimento de padrões. Hopfield é chama de uma rede de memória associativa pois consegue armazemar memória através da associação de informações existentes na comunicação entre vários neurônios. Uma das implicações disso é a capacidade de recuperar esse padrão mesmo quando dado um padrão incompleto.
Exemplo do Funcionamento
Imaginemos que, semelhantemente ao sudoku, também tenhamos uma matriz com posições, só que agora 3×3 e tendo apenas dois estados: “preenchida” ou “ativada”(denotada por 1), e “não-preenchida” ou “inativada” (denotada por 0). Podemos construir então “letras” preenchendo essas posições. Queremos que nosso sistema reconheça o padrão incompleto dessas letras e complete-o com sua memória:
Legal, mas como funciona o algoritmo disso!? Basicamente é com a definição das conexões que esses dois padrões têm. Partindo da hipótese que somente as posições próximas podem se comunicar (assim como neurônios, em um modelo simplificado), no padrão que pré-estabelecemos para o sistema, a comunicação entre duas posições preenchidas é considerada excitatória, ou seja, uma posição influencia a outra a permanecer ativada; já quando uma posição não-preenchida se comunica com uma preenchida, a comunicação é considerada inibitória; e por fim, quando duas posições não-preenchidas estão uma ao lado da outra, há indiferença e não há ativação ou inibição entre si (ver imagem abaixo). Com isso podemos criar uma rede de comunicação característica de cada figura com os pesos dos padrões.
Para a rede reconhecer ambos os padrões, deve-se somar os pesos dos padrões L e T:
Cada peso de comunicação da soma dos pesos é computada para reestabelecer um dos padrões da memória dado um padrão incompleto. Vejamos o exemplo da imagem abaixo: um L incompleto. Para decidir se a posição não-preenchida se preencherá é preciso computar o padrão incial em relação aos pesos na “memória da rede” com a expressão abaixo, em que wik é o peso da interação entre a posição em questão (denotada por i) e uma determinada posição k.
Então somando-se os produtos entre os estados xk (das k posições comunicando-se com a posição incompleta) e os pesos wik das interações entre as k posições e a posição incompleta, define-se o estado que a posição incompleta deve ter: se é de fato um estado inativado ou ativado (preenchido):
x(3,1) = 1 . 1 + 0 . 1
x(3,1) = 1
Portanto, segundo a interação associativa da rede, a posição (3,1) torna-se em um estado ativado (1) completando a letra L. Para diferentes inputs o cálculo é o mesmo e (com algumas exceções) o sistema sempre se ajusta à um dos dois padrões de sua memória: ou um L ou um T.
Como Fazer isso com Bactérias
Assim comom no sudoku, podemos criar diferentes populações de bactérias para cada posição além de – pelo mesmo mecanismo – uma rede de transmissão de RNAs antisense por vírus baseando-se na tabela de pesos das interações entre as populações existentes (a “memória” do sistema), de modo que cada posição tenha os antisense corretos para reprimir ou estimular a produção de uma determinada proteína repórter para cada posição! O que se diferenciaria do sudoku é que precisaríamos construir um aparelho literal do sistema que queremos construir, ou seja: é preciso separar as diferentes populações para discernir os outputs para saber ao certo qual população referente emitiu luz verde por GFP, por exemplo. O input também poderia ser luz, feito através de um light switch.
E assim o ciclo das relações um tanto improváveis se fecha. Mas como a ciência é extremamente mutável vários outros assuntos podem se juntar nessa ciranda e dar origem a outras “improbabilidades”. Você, leitor, também pode fazer parte desse trabalho ou pelo menos acompanhar de perto e conhecer um pouco melhor sobre essas coisas que andam rolando nas discussões do clube de biologia sintética através das reuniões gravadas, em especial (sobre como fazer uma rede neural artificial em bactérias) essa aqui no nosso canal no LiveStream.
Quem sabe possamos colocar em prática tudo isso!? Vejamos em 2012!
Brasil no iGEM
Para quem acha, não somos o primeiro grupo a ambicionar ir a um evento do iGEM. Lá pelos idos de 2009 o Brasil participou pela primeira vez da competição representado pela Unicamp, conseguindo trazer aqui para o lado de baixo do hemisfério uma medalha de ouro já “de cara”, equiparando-se às universidades mais renomadas do mundo, como Cambridge, Harvard e outras.
Sob o projeto intitulado “Microguards”, o time brasileiro criou um mecanismo de transformação de E.Coli’s e de leveduras (S. Cerevisiae) em “micro guardas”, que atacam bactérias contaminantes de biorreatores de etanol, no caso as bactérias do gênero Lactobacillus (do tipo daquelas que regulam a sua ação intestinal quando você bebe o seu leite fermentado – Yakult, Chamyto, e etc -). Usar um mecanismo como esse na indústria brasileira evitaria o atual desperdício de milhares de litros de álcool que deixam de ser produzidos por causa do açúcar consumido pelos microorganismos invasores nos bioreatores de etanol. Cerca de 5 à 10 % da produção é desperdiçada por causa desses ladrõezinhos.
O Mecanismo
Reconhecimento
“ColiGuards”
Criando uma espécie de “sistema imune de bioreatores”, duas linhagens de E.coli’s são criadas no meio de cultivo: a linhagem natural chamada de workers linage e a linhagem de “microguards”, ou killers linage; a população dos dois tipos de linhagem varia dependendo do grau de contaminação do meio, ou seja, quando não há contaminantes, muito poucas bactérias workers transformam-se em killers e vice-versa.
A transformação em killers é ativada por, um metabólito secundário de quorum sensing, AI-2 (se quiser saber mais clique aqui), que é liberado tanto pela bactéria contaminante quanto pelas E.Coli’s selvagens, é reconhecido pelas E.Coli workers, que não produzem AI-2, o que as induz a diferenciarem-se em killers. Além disso elas podem detectar os contaminates através da conjugação bacteriana com os microorganismos invasores, abilidade que só as killers passam a ter no processo de diferenciação, utilizando-a apenas naqueles microorganismos que possuem um plasmídeo diferente do seu (veja “recognition by conjugation” aqui).
“YeastGuards”
Para as Leveduras o mecanismo de reconhecimento da presença de contaminantes é um pouco mais simples: a produção de lactato provinda do consumo de açúcar dos Lactobacillus é utilizada para ativar gatilhos gênicos – o que somente é possível através da sensibilização das leveduras ao lactato, utilizando uma permease expressa pela levedura para facilitar sua incorporação à célula – que induzem um ataque aos contaminantes.
Diferenciação
Os brasileiros aproveitaram o elegante design feito pelo time francês da universidade de Paris no iGEM de 2007 para criação de um sistema de diferenciação das E.Coli’s em microguards. Com a atuação de uma recombinase (a cre recombinase), parte dos genes do plasmídeo que transforma o microorganismo sofre excisão, tornando-se um pequeno pedaço de DNA circular com baixa taxa de atividade e sem origem de replicação, enquanto os outros genes que permaneceram no plasmídeo passam a se tornar ativos devido ao seu reposicionamento na fita de DNA logo após um promotor, como pode ser visto na imagem logo abaixo:
Lox71 e lox66 são os sítios do DNA onde atuam as cre recombinases (atuação simbolizada pelo raio vermelho). Após sua ação, os genes após as regiões de terminação (T) são reposicionados - no caso do exemplo o gene dapA - próximos ao promotor que antes era da região excisionada (na imagem o promotor Tet), e por isso tornam-se ativos.
O controle populacional dos microorganismos killers é mantido através do gene ftsK da imagem acima: um gene que produz uma proteína determinante na divisão celular, sendo uma “máquina literal de segregação de cromossomos”. Dessa maneira, evita-se que a população de killers cresça demais e se torne um “tiro pela culatra”, diminuindo a produção de etanol.
Outro aspecto bastante interessante da construção das ColiGuards é o mecanismo de controle de uma população basal de killers em um biorreator não contaminado. Eles usaram uma criativa construção feita por outro time do iGEM, o de Caltech de 2008, que se aproveitou de uma “falha” da atividade da DNA-polimerase para randomizar a expressão de um gene em uma população bacteriana. Essa “falha” é a característica que a polimerase possui de ignorar ou repetir algumas sequências de nucleotídeos que são repetidas longamente no código, produzindo uma cópia de DNA com um número variável dessas repetições (fenômeno chamado de SSM, do inglês: slipped-strand mispairing), a consequência disso é que a sequência codificadora (o gene) pode ser deslocada da posição correta em relação ao seu start codon se as repetições não forem múltiplas de 3 (porque cada códon é constituído de 3 nucleotídeos), e assim a tradução não é feita corretamente. Veja figura abaixo:
As letras maiúsculas correspondem cada uma a um aminoácido, traduzido por um códon (grupo de três nucleotídeos). ATG é o start codon e TAA é um codon de parada formado pelo deslocamento da sequência codificadora. Repare que após uma SSM, uma repetição foi omitida.
Assim, as replicações de DNA que tiverem as repetições múltiplas ATGC múltiplas de três, terão o ajuste correto da região codificadora em relação ao start códon e a tradução correta da cre recombinase será possível:
Alguns tipos de Slipped Strand Mutation que podem acontecer na população de E.Coli's.
Como esse tipo de erro da DNA-polimerase não é tão frequente, apenas uma pequena parte da população se diferenciará em killer se as repetições forem colocadas antes do gene da cre recombinase.
Para diferenciar bactérias workers na vizinhança de contaminantes, todos os microguards possuem uma outra cópia do gene recombinase, mas controlado por um promotor sensível ao AI2 liberado pelos Lactobacillus e pelas Coliguards quando detectam a presença dos invasores (figura ao lado).
Mecanismo de Ataque
A construção desses mecanismos de ataque aproveitou-se da maior diferença estrutural entre as E.coli’s e Leveduras, e o Lactobacillus: a coli é uma bactéria Gram negativa (possui duas membranas celulares, existindo entre elas uma fina parede celular) e o invasor é Gram positivo (possui apenas uma parede celular no exterior e uma membrana celular interior do compartimento celular), enquanto a parede celular das leveduras é constituída de carbohidratos, diferentemente dos peptídeoglicanos do contaminante. Sabendo disso, o grupo resolveu expressar substâncias que ataquem a parede celular de peptídeoglicanos exposta dos Lactobacillus e encontraram as lisozimas como a arma perfeita para isso, sendo usadas tanto na secreção como no método kamikaze.
O grande problema dos métodos de secreção é que eles podem se comportar como contaminantes, além da consequente redução do grau de efetividade da enzima durante o tempo devido à seleção natural. A solução encontrada para esse problema foi a conjugação de um plasmídeo (lembrando que somente as killers têm a abilidade de conjugação!) com o gene de uma endonuclease, a colicina, destruindo os Lactobacillus “por dentro”. Para que as próprias E.coli’s não fossem afetadas por esse gene letal, foi inserido um gene de resistência que torna a expressão de colicina inofensiva às Coliguards.
iGEM 2009
Melhor do que descrever como foi o projeto, nada melhor do que as próprias pessoas que participaram do evento para explicarem o que fizeram! Confira a apresentação do grupo brasileiro no Jamboree realizado em 2009 no MIT:
E nesse ano há outro time em associação com a universidade francesa de Saint-Etienne, com o projeto intitulado “Stress Wars”. Confira o que já está sendo feito nesse novo projeto franco-tupiniquim grupo junto aos outros links interessantes logo abaixo:
- UNICAMP-EMSE team 2011: http://2011.igem.org/Team:UNICAMP-EMSE_Brazil
- UNICAMP-Brazil team 2009: http://2009.igem.org/Team:UNICAMP-Brazil
- Caltech team 2008: http://2008.igem.org/Team:Caltech
- Paris team 2007: http://parts.mit.edu/igem07/index.php/Paris
Inside iGEM: Eventos Passados
A competição surgiu oficialmente em 2005, resultado do período de atividades independentes (AIP) do MIT, em que a universidade, assim como muitas outras, abre as portas para cursos fora do período letivo, na época de férias. Respectivamente nos anos de 2003 e 2004, times de estudantes do próprio MIT desenvolveram osciladores biológicos com proteínas-repórter fluorescentes (como vimos aqui no blog) e sistemas genéticos para criar padrões celulares (Imagem abaixo) como os de “pontinhos” (chamados de polka dots) e de “alvo” (chamados de bull’s eye formation).
Ainda em 2004, junto com as atividades do AIP, foi criada a “Summer Competition”, uma competição à lá iGEM mas com apenas cinco universidades participantes, todas norte-americanas:Boston University, Caltech, o próprio MIT, Princeton University e a University of Texas at Austin; foi a primeira verdadeira competição de biologia sintética.O grande destaque dessa competição pré-iGEM foi a universidade do Texas, que segundo a página da competição criou o primeiro filme fotográfico biológico do mundo, o “Coliroid Film” (Imagem acima).
Esse evento acabou impulsionando Randy Rettberg, Tom Knight e Drew Endy a fundarem em 2005 o evento internacional que conhecemos hoje, com cerca de 13 times, com os mais variados projetos.
Destaques
Desde o período de atividades independentes de 2004 até 2010, 434 times e projetos já participaram da competição, com idéias e soluções criativas e inovadoras para problemas da humanidade, o que torna difícil apresentar todos os destaques das competições além dos finalistas e vencedores do Biobrick Trophy.
Logo no início, em 2005, enquanto a competição ainda estava engatinhando e os critérios de julgamento ainda não estavam bem consolidados, não houve um BioBrick Trophy e houveram até algumas premiações um tanto não-convencionais em comparação aos iGEM’s que se seguiram, como o “Best ‘Show Must Go On’ Moment” dado à Princeton, o “George W.Bush Geography Award” (provavelmente uma brincadeira envolvendo as gafes geográficas do ex-presidente norte-americano) dado à universidade de Zurique, e o “Best Project Name” dado à universidade de Toronto devido ao trocadilho com o nome do time e o projeto: “Cell-See-US”, que desenvolveu um tipo de termômetro com bactérias, fazendo uma analogia à unidade Celsius de medida de temperatura.
Alguns destaques interessantes da competição desse ano foram:
Harvard: Criaram componentes que escrevem e apagam para um “caderno de desenho bacteriano”, utilizando luz e calor para respectivamente induzir a expressão e degradar proteínas repórter em uma placa.
UCSF (Universidade da Califórnia, São Francisco): Desenvolveram termômetro biológico programável, apesar de início, segundo a wiki de 2006, ambicionarem apenas um detector biológico de temperatura. Ganhador do primeiro “Best Device Award” do iGEM.
Penn State: Construiram um mecanismo genético de controle quimiotáxico usando BioBricks. Ganhador do “Best Brick Award”.
| Terceiro Lugar | Segundo Lugar | Vencedor | |
| 2010 |  |
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| 2009 |  |
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| 2008 |  |
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| 2007 |  |
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| 2006 |  |
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Durante a avaliação dos projetos são escolhidos 5 finalistas, dentre eles figuram com frequência a Imperial College of London e UC Berkeley, além das famosas como Cambridge e Harvard. Fama também o que a Universidade da Eslovênia – do modesto país europeu – tem ganhado com essa competição: três vezes campeã e uma vez entre os 5 finalistas em 2007; contrariando a expectativa de reproduzir o ranking das melhores universidades do mundo, o que é confirmado pela forte presença das universidades asiáticas como a de Peking e a USTC.
É nesse ambiente plural e rico cientificamente (e porque não culturalmente?) em que florescem os projetos em biologia sintética mais impressionantes e competitivos todos os anos, mas muita coisa mudou desde 2006, e é sobre isso que vamos falar no próximo post da série Inside iGEM: O Futuro e Hoje.
Por falar em futuro, e o país do futuro? Onde entra nessa história!? Nós aqui da usplândia não somos os primeiros a pensar no iGEM. Veremos também a participação tupiniquim representada pela Unicamp em 2009 e agora em 2011. Então, até o próximo post!
iGEM Videos
Antes do segundo post da série “Inside iGEM” que vem por aí no blog, nada melhor do que ouvir os próprios estudantes dos times participantes para descobrir como foram algumas das edições passadas. E o melhor, em vídeos feitos por eles mesmos!
Talvez o que mais mostre a experiência do que foi ter participado na elaboração de um projeto para a competição, no melhor espírito que os alunos de Graduação especialmente têm, seja o do time da Universidade de Southtampton de 2009.
The iGEM experience:
[youtube=http://www.youtube.com/watch?v=13SVRfxGZko]
(Repare de 1:50 a 2:10!)
É claro que quando se encabeça um projeto, deve-se saber como “vender o próprio peixe”. Há vários vídeos extremamente bem explicativos no YouTube, além da própria wiki dos times, que explicam o que é o projeto e mostram sua aplicabilidade (veja alguns links no final do post), mas particularmente, o da Universidade de Edinburgo, com as suas E.Coli’s “MineBusters”, é o mais original já feito (até agora) para o iGEM. Dêem uma olhada:
The MineBusters:
[youtube=http://www.youtube.com/watch?v=QLsmjL3RIKw]
Além da concepção do projeto, a criatividade e bom humor (sem falar no talento) fazem parte de muitos times da competição. Outro vídeo musical, feito pelo time de Cambridge de 2010, mostra o drama da inserção de genes em um vetor (um plasmídeo) solucionado através do uso da técnica de Gibson Assembly (Técnica que une dois fragmentos de DNA, notável pelo número e tamanho de fragmentos que pode associar com apenas uma única reação). Uma ótima canção para você cantar aos seus colegas de laboratório (mas só se você cantar bem como a garota do vídeo!).
The Gibson Assembly Song:
[youtube=http://www.youtube.com/watch?v=WCWjJFU1be8&feature=related]
Links para outros vídeos interessantes:
- Project Firefly, do time de Cambridge de 2010.
- Projeto da École polytechnique fédérale de Lausanne, em que modificam a bactéria do gênero Asaia para combater a Malária.
- Projeto “Essencia Coli”, do time de 2009 da universidade belga K.U.Leuven.