O Bloqueio dos Prótons

Este √© o √ļltimo post da s√©rie sobre as aquaporinas, um dos mais “geniais” sistemas de transporte molecular j√° descoberto, que contou com os posts¬†O Poder dos Pr√≥tons e Uma Passagem para √Āgua.

Do ponto de vista biol√≥gico, portanto, faz sentido as aquaporinas n√£o permitirem a entrada de esp√©cies protonizadas. Mas, do ponto de vista bioqu√≠mico isso n√£o √© t√£o simples. A pergunta “Como?” √© a que deve ser cientificamente respondida, mas apenas recentemente ¬†estudos com simula√ß√Ķes elucidaram os mecanismos de bloqueio dos pr√≥tons.

S√£o tr√™s os dispositivos capazes de efetuar o bloqueio dos pr√≥tons pelas aquaporinas[1,2]. A pergunta sobre qual seria o mais importante, ainda se constitui objeto de discuss√£o acad√™mica. A figura abaixo mostra o canal de uma subunidade da AQP1 onde quatro mol√©culas de √°gua (de cor mais forte, no centro) demonstram as intera√ß√Ķes com os res√≠duos amino√°cidos da estrutura do canal. Os mecanismos s√£o:

(a) Estreitamento. Por restri√ß√£o de tamanho, pouco acima do ponto m√©dio do canal, o poro se estreita de 8 √Ö para 2,8 √Ö (aproximadamente o di√Ęmetro de uma mol√©cula de √°gua). Isso provoca a desidrata√ß√£o do H3O+, o que obrigaria a mol√©cula a desfazer-se de sua carga.

Figura 1. Mecanismos de bloqueio de prótons pelas aquaporinas. (modificado de [1])

(b) Repuls√£o eletrost√°tica. Um res√≠duo de arginina (R-195, na figura) na regi√£o de maior estreitamento do poro imp√Ķe uma barreira aos c√°tions, incluindo o H3O+. No foco da controv√©rsia, alguns estudos mostram que talvez esse mecanismo seja o mais importante no bloqueio dos pr√≥tons pois ele est√° presente virtualmente em toda fam√≠lia das AQP. A retirada deste res√≠duo reduz drasticamente a especificidade aos pr√≥tons.

(c) Reorienta√ß√£o do dipolo. Duas h√©lices parciais formadas por res√≠duos Asn-Pro-Ala (chamados NPA motifs) se encontram no meio do canal, formando um campo magn√©tico bipolar que alinha a mol√©cula de √°gua atrav√©s da forma√ß√£o de duas pontes de hidrog√™nio. Isso orienta perpendicularmente a √°gua, fazendo com que as pontes O-H apontem para fora do canal, impedindo a condut√Ęncia dos pr√≥tons pelo efeito Grotthuss. Mais elegante, esse mecanismo foi o proposto inicialmente [3,4].¬† A figura 2 mostra como o campo magn√©tico bipolar exige que a mol√©cula de √°gua tenha uma orienta√ß√£o espec√≠fica para entrar no canal a um baixo custo de energia.


Figura 2. Modelagem da organiza√ß√£o preferencial da cadeia de mol√©culas de √°gua da aquagliceroporina (GlpF) de E. Coli. (Acima) Tr√™s conforma√ß√Ķes representativas da cadeia de √°gua. (A) Com as pontes de H orientadas para o extracelular. (B) Conforma√ß√£o prefer√≠vel. Note que entre a mol√©cula 6 e a 7, o alinhamento entre H e O (branco e vermelho, respectivamente) √© quebrado. (C) Com as pontes de H orientadas para o intracelular. (Abaixo) Gr√°fico ilustrando a energia necess√°ria para a reorienta√ß√£o das mol√©culas de √°gua (nas abscissas) e a orienta√ß√£o das pontes de H (ordenadas) por duas metodologias diferentes (linhas vermelha e verde). As letras A, B e C correspondem √†s conforma√ß√Ķes acima, sendo a B a de menor trabalho termodin√Ęmico . (A partir da refer√™ncia [3])

Os dispositivos de bloquear pr√≥tons presentes nas aquaporinas, seja pelo posicionamento estrat√©gico de cargas ao longo de um canal, seja pelo “desengajamento” da corrente de mol√©culas de √°gua que quebra o “teletransporte” dos pr√≥tons, s√£o exemplos interessantes da “luta” na qual os seres vivos se envolveram para chegarmos onde estamos. Tal luta n√£o se d√° apenas no n√≠vel macrosc√≥pico da concorr√™ncia entre as esp√©cies e a sele√ß√£o natural. Ela ocorre tamb√©m no n√≠vel subcelular – das mol√©culas -, e mostra a dificuldade de resistir e manter-se est√°vel na agressividade do ambiente natural, o que pode bem ser entendido como “viver”. Parece, ent√£o, ter sido evolutivamente vantajoso para c√©lula manter os sistemas de transporte de √°gua e pr√≥tons separados de modo a poder controlar o volume e a concentra√ß√£o dos solutos do citoplasma, por um lado, e o metabolismo energ√©tico, por outro, de forma independente[4]. A fam√≠lia das AQPs √© filogeneticamente antiga, estando presente nos procariotas, o que indica a urg√™ncia desse controle j√° nos prim√≥rdios da vida na Terra. De fato, domar precocemente as vicissitudes da √°gua parece mesmo ter sido imprescind√≠vel¬†para que os seres vivos¬†prosseguissem dependendo dela.

 

Referências Bibliográficas

[1] Kozono D, Yasui M, King LS, et al.: Aquaporin water channels: atomic structure molecular dynamics meet clinical medicine. J Clin Invest 109:1395-1399, 2002.

[2] Chen H, Wu Y, Voth GA: Origins of proton transport behavior from selectivity domain mutations of the aquaporin-1 channel. Biophys J 90:L73-75, 2006.

[3] Chakrabarti N, Tajkhorshid E, Roux B, et al.: Molecular basis of proton blockage in aquaporins. Structure 12:65-74, 2004.

[4] Eisenberg B: Why can’t protons move through water channels? Biophys J 85:3427-3428, 2003.

Uma Passagem para a √Āgua

Este post faz parte de uma série cujo primeiro é O Poder dos Prótons.

Na fisiologia clássica, por volta da década de 20, quando se descobriu que a membrana plasmática das células era uma dupla camada lipídica, formulou-se a hipótese de que a água pudesse penetrar no meio intracelular através da própria membrana, seguindo forças osmóticas. Entretanto, uma série de pesquisadores, por meio de medidas biofísicas (que analisam potenciais de membrana), notaram que a permeabilidade de algumas membranas à água era 10 a 20 vezes maior do que a esperada caso a passagem ocorresse apenas através delas[1]. Previram, assim, a existência de um canal para passagem da água.

No in√≠cio da d√©cada de 80, Peter Agre era um hematologista envolvido no estudo do fator Rh (o “positivo” ou “negativo” dos tipos sangu√≠neos) trabalhando no Instituto Nacional de Sa√ļde dos EUA. Estava interessado em induzir a forma√ß√£o de anticorpos em coelhos sensibilizando-os com um pept√≠deo parcialmente purificado do fator Rh. Os coelhos reagiam fortemente produzindo anticorpos que, no entanto, n√£o reagiam com o cerne da mol√©cula de Rh mas sim, com uma outra prote√≠na que acreditava-se ser um fragmento do grande polipept√≠deo. Parecia uma contamina√ß√£o do experimento. Mas essa prote√≠na de 28 kilodaltons (kDa), tinha algumas propriedades estranhas. N√£o se corava com os procedimentos habituais e quando¬†foram procur√°-la¬†na membrana de hem√°ceas, verificou-se que era extremamente abundante. Com aproximadamente 200.000 c√≥pias por hem√°cea, era uma das prote√≠nas mais comuns na c√©lula! Nas palavras de Agre (descendente de imigrantes n√≥rdicos)¬†‚Äúera como se algu√©m, andando pelo norte des√©rtico da Su√©cia, de repente, encontrasse uma cidade de 200.000 habitantes que n√£o constasse em nenhum mapa‚ÄĚ. Estudos subsequentes revelaram que a prote√≠na tinha caracter√≠sticas de um canal pois dispunha-se ao longo da espessura da membrana. Uma s√©rie de elegantes experimentos revelou que ela era um canal de √°gua sendo batizada com o sugestivo nome de aquaporina 1 (AQP1). Peter Agre recebeu o pr√™mio Nobel de Qu√≠mica em 2003 por sua descoberta (Figura abaixo). Orgulho do pai, que havia trabalhado com Linus Pauling, acabou abandonando a hematologia. (Veja a interessant√≠ssima “palestra do pr√™mio” (em ingl√™s, 45 min) no portal do Nobel).


Figura 1. Peter Agre. Prêmio Nobel de Química de 2003

As aquaporinas constituem uma fam√≠lia de, at√© o momento, algumas centenas de prote√≠nas de membrana. Nos mam√≠feros j√° foram identificadas doze, sete das quais est√£o presentes no rim. Nos √ļltimos anos, pesquisas t√™m explorado a seletividade e as fun√ß√Ķes multitransportadoras das aquaporinas. Isso levou a uma divis√£o do grupo em aquaporinas cl√°ssicas e aquagliceroporinas. Estas √ļltimas tamb√©m transportam passivamente glicerol e outros poli√≥is bem como alguns solutos e, ao que parece, s√£o filogeneticamente at√© mais antigas que as aquaporinas cl√°ssicas[2].¬†A AQP1 √© uma prote√≠na de membrana altamente perme√°vel √† √°gua. Sua condut√Ęncia √© de aproximadamente 3 x 10^9 molec / subunidade / seg permitindo que uma mol√©cula de √°gua trafegue a ~0,02 cm/s [3]. A AQP1 forma 4 complexos na membrana celular (subunidades), cada um formando um canal de √°gua independente (figura 2). Um quinto poro √© formado no centro do complexo e h√° ind√≠cios de que possa conduzir √≠ons, mas o transporte passivo de √°gua atrav√©s da membrana celular √© mesmo a maior fun√ß√£o fisiol√≥gica da AQP1 [4].

Figura 2. Foto de simula√ß√£o do transporte de √°gua por uma mol√©cula de aquaporina. As subunidades s√£o constitu√≠das de t√ļbulos que est√£o em cores diferentes. As mol√©culas de √°gua (pequenos bumerangues azuis) permeiam a subunidade √† direita (em dourado). Esta imagem ganhou o pr√™mio de melhor foto cient√≠fica da revista Science‚ĄĘ na edi√ß√£o de 24 de Setembro de 2004¬†e pode ser encontrada aqui, juntamente com uma anima√ß√£o do transporte das mol√©culas de √°gua.

√Č surpreendente o fato de que, mesmo transportando √°gua t√£o eficientemente, as aquaporinas sejam imperme√°veis aos √≠ons. A raz√£o disso seria a prote√ß√£o do meio interior celular para que a maquinaria metab√≥lica possa funcionar adequadamente e em “sil√™ncio biol√≥gico” – o que pode at√© ser uma defini√ß√£o bonita de Sa√ļde, mas teleol√≥gica demais para servir a nossos prop√≥sitos. At√© o mais enxerido de todos √≠ons, o pr√≥ton e seu alterego H3O+, n√£o consegue passar pelas reentr√Ęncias do canal de √°gua. Como isso se d√°? Como isso ocorre se os pr√≥tons teleportam-se de um lugar¬†para outro¬†livremente na¬†Mattrix aqu√°tica, materializando-se e evaporando em qualquer lugar¬†bastando para isso um “fio de √°gua” por onde possam passar…

√Č o que tentarei descrever no pr√≥ximo e √ļltimo post da s√©rie.

Referências Bibliográficas

[1] Finkelstein A: Water Movement Through Lipid Bilayers, Pores, and Plasma Membranes: Theory and Reality (Distinguished Lecture Series of the Society of General Physiologists). New York, John Wiley & Sons Inc, 1987.

[2] Nielsen S, Frokiaer J, Marples D, et al.: Aquaporins in the kidney: from molecules to medicine. Physiol Rev 82:205-244, 2002.

[3] Preston GM, Carroll TP, Guggino WB, et al.: Appearance of water channels in Xenopus oocytes expressing red cell CHIP28 protein. Science 256:385-387, 1992.

[4] Zhu F, Tajkhorshid E, Schulten K: Theory and simulation of water permeation in aquaporin-1. Biophys J 86:50-57, 2004.

O Poder dos Prótons

H√° um poder, silencioso e gigantesco que, entre outras coisas, √© o respons√°vel pela √°gua na forma como a conhecemos no nosso planeta. Se¬†a √°gua √©, por sua vez,¬†a matriz de todas as¬†formas vivas daqui, ent√£o tal poder tamb√©m estar√° presente em cada ser vivo. A explos√£o de vida da Terra teve que lidar com ele para que pudesse florescer e, de fato, quando nos escapa esse controle, uma fera enjaulada foge e a vida diminui ou mesmo acaba. Podemos chamar isso de “doen√ßa”. Nos pr√≥ximos posts vou tentar contar a hist√≥ria do Poder dos Pr√≥tons e seus desdobramentos na fisiologia e fisiopatologia dos seres vivos, em especial, dos humanos.

O Hidrog√™nio poderia, para todos os efeitos, ser considerado um elemento-tra√ßo. Para se ter uma ideia, sua concentra√ß√£o √©¬†3,5 milh√Ķes de vezes menor que a do S√≥dio nos fluidos org√Ęnicos. No soro, ela √© da mesma ordem de grandeza do Molibd√™nio (20 nM/L) e bem menor que concentra√ß√Ķes de elementos como Zinco (15 mM/L), Cobre (20 mM/L) e Sel√™nio (1 mM/L) [1].¬†Como pode o Hidrog√™nio com uma concentra√ß√£o de 0,000 000 040 M/L ou 40 nM/L influenciar t√£o decisivamente os processos biol√≥gicos? Quais as raz√Ķes que levam o √≠on hidrog√™nio a desempenhar um papel t√£o importante?

A primeira delas √©, sem d√ļvida, a √°gua. Todos os fen√īmenos biol√≥gicos ocorreram e ocorrer√£o sempre em solu√ß√Ķes aquosas desde que a estrutura celular que caracteriza os seres vivos neste planeta seja mantida. A √°gua tem, como se sabe, estranhas propriedades quando comparada a outros hidretos da fam√≠lia do Oxig√™nio (a fam√≠lia 6A na tabela peri√≥dica ‚Äď Enxofre, Sel√™nio, Tel√ļrio e Pol√īnio): altos pontos de fus√£o e ebuli√ß√£o, alta constante diel√©trica (conduz correntes bem), alta tens√£o superficial (forma gotas muito resistentes), entre outras (Tabela 1).

Grupo

3A

4A

5A

6A

7A

B2H6 : -92.5

CH4 : -164

NH3 : -33.4

   H2O : +100

HF : -87.7

   H2S : -60.7
   H2Se : -41.5
   H2Te : -2

Tabela 1. A √°gua tem um ponto de ebuli√ß√£o anormalmente elevado quando comparado por extrapola√ß√£o em rela√ß√£o aos hidretos do grupo 6A (Oxig√™nio, Enxofre, Sel√™nio e Tel√ļrio). Os hidretos dos outros grupos s√£o mostrados para compara√ß√£o (3A Boro, 4A Carbono, 5A Nitrog√™nio e 7A Fl√ļor). (Retirado daqui)

A grande maioria das estranhas propriedades da √°gua prov√©m da habilidade que ela tem de formar pontes de hidrog√™nio. Como se sabe, a liga√ß√£o¬†do Oxig√™nio aos dois √°tomos de Hidrog√™nio d√° √† mol√©cula de √°gua o formato de um ‚ÄúV‚ÄĚ com um √Ęngulo de 104,5o. Essa liga√ß√£o¬†√©¬†formada por um par de el√©trons compartilhado (a chamada liga√ß√£o covalente). O Oxig√™nio, no entanto, atrai o par de el√©trons¬†para bem perto de si (maior eletronegatividade) e transforma¬†a mol√©cula de √°gua em um min√ļsculo im√£ com seus 2 p√≥los: o positivo (Hs) e o negativo (O). Quando um √°tomo de H, carregado positivamente, fica preso entre dois √°tomos de O, que t√™m cargas negativas, ele passa a funcionar como uma ponte entre os dois. Essa atra√ß√£o √© 90% eletrost√°tica e 10% covalente (h√° evid√™ncias de que eles podem realmente dividir orbitais, fazendo com que n√£o consigamos saber qual liga√ß√£o √© a covalente), e cada mol√©cula de √°gua tem o potencial de fazer 4 pontes. Al√©m disso, pode-se dizer que a ponte de hidrog√™nio √© cooperativa isto √©, uma vez formada a primeira ponte, a mol√©cula torna-se mais apta a formar outras pontes e o fen√īmeno se dissemina. O contr√°rio tamb√©m √© verdadeiro, ou seja, √© mais dif√≠cil romper a primeira ponte, sendo que a energia necess√°ria para romper as subsequentes vai, progressivamente, ficando menor. Isso transforma a √°gua em um ‚Äúsinc√≠cio‚ÄĚ, tipo um tecido tridimensional; da√≠ a poderosa for√ßa de atra√ß√£o intermolecular que dota a √°gua de seus elevados pontos de ebuli√ß√£o, fus√£o e tens√£o superficial. A forma√ß√£o das pontes de hidrog√™nio faz com que a entalpia (energia) do sistema fique mais negativa e a entropia (grau de desorganiza√ß√£o)¬†menos positiva ou, trocando em mi√ļdos: a √°gua se organiza!. Organiza-se com baixo custo, o que significa que √© dif√≠cil tir√°-la desse estado¬†de organiza√ß√£o e, na depend√™ncia da temperatura e press√£o, temos a explica√ß√£o de muitas das suas ‚Äúestranhas‚ÄĚ propriedades. Ou seja, se a √°gua fosse apenas H2O seria um g√°s na faixa de temperatura que permite que seres vivos sobrevivam. No estado l√≠quido, ela est√° na forma de (H2O)n, com¬†n‚Üí‚ąě,¬†constituindo¬†mais pontes de H que qualquer outro solvente e com quase tantas pontes quanto liga√ß√Ķes covalentes. Esse sistema √© interessante pois pode rearranjar-se rapidamente frente a est√≠mulos como solutos ou altera√ß√Ķes de temperatura, como uma rede tridimensional capaz de mudar o tamanho de seus “buracos” de acordo com o tamanho dos “peixes” que nela caem.

Al√©m disso, a √°gua demonstra uma extremamente baixa mas mensur√°vel capacidade de formar √≠ons. Ioniza-se devido a flutua√ß√Ķes do campo magn√©tico de seu dipolo causadas por vibra√ß√Ķes complexas de sua estrutura molecular e tamb√©m por posicionamentos espaciais favor√°veis de suas pontes de H. Ap√≥s a ioniza√ß√£o, o H+ n√£o permanece livre muito tempo (menos que 1% do tempo total) e √© hidratado para formar o hidrox√īnio, ox√īnio ou hidr√īnio¬†(H3O+). Os tr√™s √°tomos de H da mol√©cula s√£o equivalentes na liga√ß√£o com o O e organizam as pontes com as mol√©culas de √°gua adjacentes. O H3O+ exibe uma mobilidade frente aos campos el√©tricos de testes que √© absurdamente maior que a prevista para um c√°tion monovalente (como o L√≠tio, por exemplo, que apresenta inclusive uma forma de hidrata√ß√£o semelhante). Qual seria a explica√ß√£o para esse fen√īmeno?

Um pr√≥ton pode viajar em uma solu√ß√£o aquosa de duas maneiras: uma, chamada hidrodin√Ęmica, em que o H3O+ difunde-se como uma mol√©cula comum abrindo caminho pelo meio aquoso; outra, chamada prototr√≥pica e essa merece uma explica√ß√£o. Em 1905 [2], foi sugerido que a transfer√™ncia do pr√≥ton poderia ocorrer por uma ‚Äúrede‚ÄĚ de pontes de hidrog√™nio, um processo que envolveria uma s√©rie peri√≥dica de polimeriza√ß√Ķes da √°gua entre H9O4+ (c√°tion de Eigen) e o H5O2+(c√°tion de Zundel), conhecido como efeito Grotthuss [3], proton-wire ou proton-jumping, ou ainda water-wire. Isso s√≥ √© poss√≠vel, devido √† ef√™mera dura√ß√£o da ponte (cada ponte tem uma dura√ß√£o m√©dia de 10 psec, sendo que 1 picosegundo = 10-12s) e √† facilidade com que a √°gua as forma e “re-forma”, como vimos. Dizemos ent√£o, que a alta condutividade do pr√≥ton em meio aquoso ocorre devido a ‚Äúmudan√ßa de identidade das mol√©culas de √°gua que participam das pontes‚ÄĚ pois os n√ļcleos de H v√£o passando de uma para outra conforme esbo√ßa a figura 2, sendo que o que entra, √© diferente daquele que sai.

Figura 2. Esquema simplificado do efeito Grotthuss

 Isso funciona parecido com o hipnotizante Pêndulo de Newton, na figura abaixo.

Pêndulo de Newton (fonte Wikipédia)

Mas…

O √≠on hidrog√™nio tem uma densidade de carga alt√≠ssima e isso ocorre porque ele √© um c√°tion-an√£o (monovalente no qual n√£o existem el√©trons circulantes) sendo seu raio 105 vezes menor que qualquer outro. Por essa raz√£o, tem um grande campo magn√©tico ao seu redor. Assim, mesmo estando presente em concentra√ß√Ķes baix√≠ssimas nas solu√ß√Ķes e devido sua alta mobilidade, o H3O+¬†√© um “pentelho i√īnico” e pode afetar a conforma√ß√£o de prote√≠nas, √°cidos nucl√©icos e membranas biol√≥gicas, bastando para tal, que haja uma ‚Äúbrecha‚ÄĚ eletrost√°tica (cargas) na solu√ß√£o. Esse √© o ‚Äúpoder dos pr√≥tons‚ÄĚ, capazes de alterar todos os processos biol√≥gicos, portanto. Fen√īmenos semelhantes ocorrem com a hidroxila OH entretanto, sua mobilidade nas solu√ß√Ķes tem sido bem menos estudada. Pesquisas recentes [4] demonstram que sua mobilidade tamb√©m √© anormalmente alta para um √Ęnion de seu porte e, portanto, mecanismos semelhantes ao do H3O+ podem tamb√©m ocorrer. Tanto o H+ como o OH s√£o gerados pela destrui√ß√£o e destru√≠dos pela forma√ß√£o de uma mol√©cula de √°gua. Se considerarmos que a √°gua √©, em ordem de grandeza, a mais concentrada subst√Ęncia dos sistemas vivos (55,3M ‚Äď o que √© 400 vezes mais concentrado que o s√≥dio), e que ela prov√™ uma fonte simplesmente inesgot√°vel para esses √≠ons, entenderemos porque eles se comportam de maneira t√£o diferente de outros √≠ons de carga e massa semelhantes.

Com toda essa mobilidade e onipresen√ßa, √© natural esperar que pr√≥tons penetrem as c√©lulas com facilidade, podendo faz√™-lo atrav√©s da membrana ou por meio de canais, espec√≠ficos ou n√£o, para seu transporte. Tal fluxo √© t√£o fundamental quanto o de √°gua para a c√©lula, pois est√° ligado √† produ√ß√£o da energia que sustenta o metabolismo celular. Mas como evitar ent√£o, que o transporte de √°gua em abund√Ęncia atrav√©s da membrana n√£o cause uma cat√°strofe i√īnica na c√©lula? Como evitar que os “pentelhos i√īnicos” dos H3O+¬†saturem as cargas das prote√≠nas e as deformem fazendo com que percam sua fun√ß√£o e, assim, parem o funcionamento da maquinaria celular?

√Č o que mostraremos no pr√≥ximo post.

Referências Bibliográficas

[1]  Tietz N: Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd ed. Philadelphia, W. B. Saunders, 1995

[2]  Decoursey TE: Voltage-gated proton channels and other proton transfer pathways. Physiol Rev 83:475-579, 2003.

[3]  Agmon N: The Grotthuss mechanism. Chem Phys Lett 244:456-462, 1995

[4]  Tuckerman ME, Marx D, Parrinello M: The nature and transport mechanism of hydrated hydroxide ions in aqueous solution. Nature 417:925-929, 2002